研究背景和目的肝衰竭(hepatic failure)是一种严重的临床综合症,常规内科治疗效果不佳,病死率高达70%左右。肝移植是终末期肝衰竭唯一有效的治疗手段,但是,目前肝源严重不足,能够接受肝移植的患者比例不足1%。生物人工肝(bioartificial liver,BAL)的出现为肝衰竭的治疗提供了一丝希望,它可以暂时辅助并部分替代严重病变的肝脏功能,帮助肝衰竭患者自身肝脏功能恢复或使其等到肝移植。但是,生物人工肝支持系统缺乏理想的肝细胞材料和高效的生物反应器,严重制约着这一新兴治疗技术的发展。目前,进入临床试验阶段的生物人工肝细胞材料主要包括猪肝细胞和肝癌细胞株C3A,但前者为异种细胞,进入人体易导致免疫排斥反应及引起动物源性传染病,后者来源为肝脏高度恶性肿瘤,具有潜在的致瘤性危险。以上生物材料均存在种种不足,还没有任何一种细胞材料能够完全符合理想生物材料的要求,国内外尚无获得官方批准认可的生物人工肝细胞产品,生物人工肝的发展也由此渐入低谷。因此,探寻合适的肝细胞材料,使其在人工肝装置中充分发挥合成、代谢、解毒等肝脏功能成为生物人工肝继续发展的重要前提和难点所在。近年来在生物人工肝的研究领域中,各国学者也从不同方面入手,探索新的细胞材料来源。如利用病毒载体将SV40LT或hTERT基因导入肝细胞而构建永生化肝细胞株;诱导干细胞等前体细胞使其定向分化为肝细胞样细胞及胆管细胞样细胞;构建新型的肿瘤来源肝细胞株等。其中,利用病毒载体构建永生化肝细胞株有使病毒滞留体内的危险,存在安全隐患,而对干细胞的诱导分化技术难度较大,诱导分化的条件及程度很难掌握,因此,这方面的一系列探索还仅仅停留在实验室研究阶段,距离临床应用差距较大。肿瘤细胞来源广泛,建株技术难度相对较小,并已有肿瘤细胞株C3A在临床试验中应用的先例,因此,受到各国学者的关注。肝功能水平的评价是衡量人工肝细胞材料最主要的标准,因此,我们之前在预实验中对现有主要12株肝脏来源的肝细胞株的肝脏功能进行了检测,发现现有肝细胞株的肝细胞功能指标的表达水平参差不齐,其中,以C3A细胞相对最好,但是,C3A细胞来源于高度恶性的肝脏肿瘤,并且国外公司对其享有专利保护。为克服现有肝细胞株功能不足、存在安全隐患以及专利保护等问题,我们便提出了用高分化肝癌组织构建新型生物人工肝细胞材料的设想,为初步验证该设想的可行性,我们首先对高分化肝癌组织的肝脏功能水平进行了检测,结果发现,高分化肝癌组织的肝脏功能水平介于癌旁正常组织及低分化肝癌组织之间,由此可推断:高分化肝癌组织具有相对较好的肝细胞功能。基于这些工作基础,从可行性、安全性和功能水平等方面考虑,本文开展了高分化肝癌细胞的建株研究,最终建立了一株来源于36岁成人高分化肝癌组织的肝癌细胞株—NHBL2,并进一步对其生物学特性、肝脏功能水平等指标进行检测,为了模拟肝细胞生长的微环境,还进行了水凝胶三维立体培养的尝试,以评价该细胞株在生物人工肝中的应用价值。方法1.人原代肝脏细胞的分离及培养标本取自南方医院肝胆外科手术切除的肝癌边缘组织(经医学伦理委员会批准,且征求并获取患者及其家属同意),采用本实验室建立的改良的小块肝组织胶原酶二步灌流法分离原代肝脏细胞。2.NHBL2细胞的传代培养及冻存与复苏原代培养的细胞通过选择性消化法和反复贴壁法去除成纤维样细胞使上皮样细胞逐渐得到纯化,并获得生长优势,其中残存的少量成纤维细胞在培养过程中逐渐被自然淘汰。在细胞的连续传代培养过程中,定期对细胞生物学特性进行检测,丢弃肝细胞特异性功能低和增殖能力弱的细胞系,而继续培养肝细胞特异性功能高和增殖能力强的细胞系,从而保证肝脏细胞具有高水平的肝细胞活性。3.长期传代培养建立细胞株人源性新型肝细胞株在体外需连续传代50代以上并连续三次检测其细胞形态和各项功能指标均稳定,不再发生明显变化。4.新型人源性肝细胞株生物学特性的检测1).形态学观察:在光学显微镜下观察细胞体积及形态变化,透射电镜下观察细胞超微结构特点。2).增殖动力学检测:连续细胞计数绘制细胞的生长曲线并计算其细胞倍增时间,流式细胞技术检测其细胞周期。3).功能检测:①肝细胞相关功能基因水平的检测:qRT-PCR法检测NHBL2细胞mRNA的表达。②肝细胞相关功能蛋白水平的检测:western-blot、免疫细胞化学及细胞免疫荧光检测肝细胞重要功能蛋白及表面标志物的表达;PAS染色检测NHBL2细胞糖原合成及储存能力;全自动生化分析仪检测NHBL2细胞培养上清中白蛋白及尿素氮的含量。③功能优化实验:应用水凝胶三维立体培养NHBL2细胞一周后,利用实时定量荧光PCR技术检测肝细胞相关功能基因的表达变化。4).安全性评价:收集NHBL2细胞株培养上清对其HBs-Ag、HBV-DNA及HCV-DNA的含量进行检测。5).遗传学特性检测:①基因组学检测:NHBL2细胞的基因结构进行全面分析并与C3A细胞相比较。②核型分析:检测该细胞株有无染色体突变及异位。结果1.分离得到的原代肝细胞贴壁后体积较大,形态呈多角形,同时可见少量长梭形间质细胞掺杂,在传代过程中细胞逐渐得到纯化。建株后细胞形态变为不规则多角形,体积小于原代肝细胞。2.增殖动力学检测:由生长曲线可看出,NHBL2细胞在贴壁后72小时开始进入快速生长期,其细胞倍增时间为27小时左右。流式细胞周期检测结果同样可见NHBL2处于S+G2/M期细胞的比例(0.335)较C3A细胞中处于S+G2/M期的比例(0.379)稍低,但二者之间差异无统计学意义(p=0.759,n=3)。3.功能检测:NHBL2细胞株各项肝功能相关指标mRNA水平的表达,除葡萄糖6磷酸略高于C3A细胞株外,其余指标均略低于C3A细胞株,二者差异较小,相差均在1-5倍之间。通过半定量、定量的方法对其基因产物的表达水平进行检测,结果与基因水平的表达大致一致。功能优化实验中,接种于水凝胶三维培养系统中的NHBL2细胞较接种前肝细胞功能相关指标的表达水平均有不同程度提高。4.安全性评价及遗传特性检测:对NHBL2细胞株培养上清的检测中,其HBs-Ag、HBV-DNA及HCV-DNA的含量均在正常值范围之内。核型分析结果提示NHBL2细胞为多倍体,部分染色体发生突变及异位。基因组学分析NHBL2细胞与C3A细胞相当部分基因表达水平具有的相似性,但部分基因的构成仍然存在差异。结论本研成功构建了一株来源于高分化肝癌组织的肝细胞NHBL2,其功能水平与C3A胞相近,但一定程度上降低了应用的安全性顾虑,研究中还进一步通过水凝胶三维培养系统对其功能进行优化提高,最终为人工肝生物材料的探寻提供了一种新的思路。