研究背景:甲状腺癌为最常见的内分泌癌症,病理学分为乳头状癌、滤泡癌、未分化癌以及髓样癌。其中,乳头状癌占全部甲状腺癌的90%,为临床上最常见类型。近年来,甲状腺癌的发病率越来越高,美国相关机构统计数据显示甲状腺癌的发病率以每年6.4%勺速度递增。与此同时,桥本甲状腺炎与甲状腺癌合并存在的现象也越来越常见,且其病理类型绝大多数为乳头状癌。已有很多学者对甲状腺乳头状癌的发病机制、预后及治疗手段等进行过研究,但对伴有桥本甲状腺炎的乳头状癌研究甚少。BRAF基因V600E突变是甲状腺乳头状癌中最常见的分子病理学改变,目前被广泛接受的甲状腺乳头状癌发病机制为,BRAFV600E突变引起Ras-Raf-MEK-ERK信号通路的持续激活刺激细胞无限分裂,使细胞增殖失控而导致肿瘤的形成。有文献报道,BRAF基因突变可影响甲状腺被膜外侵犯、颈淋巴结转移以及临床分期等临床病理参数。然而,BRAFV600E突变是否为伴有桥本甲状腺炎乳头状癌的主要基因突变形式以,以及BRAFV600E突变与其临床病理参数的关系尚不明确。临床上,病理科主要利用PCR法检测BRAF基因是否突变,并没有大量开展免疫组化法检测BRAFV600E突变蛋白来辅助诊断甲状腺乳头状癌,故利用免疫组化法检测BRAFV600E突变蛋白与PCR法检测BRAFV600E突变基因结果的一致性也有待于探究。伴有桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌组织中有大量淋巴细胞浸润,在临床工作中经常发现普通型(即经典)甲状腺乳头状癌组织中也有淋巴细胞浸润。两者浸润的淋巴细胞类型及数量是否相同,以及是否与BRAFV600E基因突变相关联等,尚未见报道。因此,本研究的目的是从蛋白水平和基因水平研究伴有桥本甲状腺炎的甲状腺炎乳头状癌BRAFV600E突变状况和浸润的淋巴细胞亚型,以及与其临床病理参数的关系,以期为伴有桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌的发生、发展、个体化治疗及预后的研究奠定基础。目的:1、研究BRAF基因V600E突变是否为伴有桥本甲状腺炎乳头状癌的主要基因突变形式以及与其临床病理参数的关系;2、研究用免疫组化法检测BRAFV600E突变蛋白与PCR法检测BRAF基因V600E突变结果的一致性;3、研究伴与不伴有桥本甲状腺炎的乳头状癌组织中浸润的淋巴细胞亚型以及是否与BRAFV600E突变相关。方法:1.选取大连医科大学附属二院2014年1月—2016年1月间临床病理资料完整的存档蜡块,其中伴桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌(PTC+HT组)23例,普通或经典型甲状腺乳头状癌(PTC组)31例,以及桥本甲状腺炎(HT组)28例。2.采用中杉金桥兔抗人BRAFV600E单克隆抗体(克隆号VE1),通过免疫组织化学方法检测三组样本(共82例)组织中BRAFV600E蛋白表达状况;采用PCR-荧光探针法检测BRAF基因V600E突变;采用中杉金桥兔抗人CD3单克隆抗体(克隆号EP41),兔抗人CD4单克隆抗体(克隆号EP204),兔抗人CD8单克隆抗体(克隆号SP16),兔抗人CD20单克隆抗体(克隆号EP7)检测三组病例组织中浸润的淋巴细胞亚型。3.实验数据统计分析使用SPSS17.0软件进行,采用独立样本t检验、方差分析、χ2检验、秩和检验以及Pearson相关性检验等方法,以p<0.05表示差异有统计学意义。结果:(一)临床资料PTC+HT组和HT组:女性患者所占比例0(分别为100.00%,89.29%)较PTC组(58.06%)高,差异具有统计学意义(P<0.05);与PTC组比较,PTC+HT组肿瘤好发于甲状腺左叶且肿瘤直径大多小于1cm,差异有统计学意义(P<0.05,见表4)。(二)BRAF基因V600E突变检测结果1、BRAFV600E蛋白表达(免疫组织化学法)结果应用免疫组化方法检测82例甲状腺组织中BRAFV600E蛋白表达,其中PTC+HT组阳性表达率(43.48%)最低(低于PTC组和HT组,P<0.01,见表5),阳性强度为弱至中等强度,评分均值为1.65±2.23;PTC组BRAFV600E蛋白阳性表达率(96.77%)最高,阳性表达强度多为中等至强阳性,评分均值为7.61±3.35;H组阳性表达率(75.00%)居中,表达强度为弱至中等强度,评分均值为3.14±2.43。各组间BRAFV600E蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05,见表5、图1,2)。2、BRAF基因V600E突变检测(PCR法)结果应用PCR—荧光探针法检测82例甲状腺组织样本BRAF基因V600E突变情况,其中PTC+HT组BRAF V600E突变率(34.78%)显著低于PTC组的突变率(80.65%),差异具有统计学意义(P<0.05);28例HT组均未见检测到BRAFV600E突变(见表5,图2,3)。3、免疫组化法与PCR法检测BRAFV600E突变结果比较本组82例样本,用免疫组化法检测BRAFV600E蛋白阳性表达者61例,PCR—荧光探针法检测BRAF基因V600E突变者33例;其中33例PCR—荧光探针法检测BRAF基因V600E突变阳性者,其免疫组化法检测BRAFV600E蛋白表达均为阳性;而免疫组化检测阳性但PCR—荧光探针法检测阴性的病例共28例(PTC+HT组2例、PTC组5例、HT组21例),此28例BRAFV600E蛋白表达强度均<(++)。4、测序法检测BRAF基因突变结果将28例免疫组化法检测BRAFV600E蛋白阳性而PCR—荧光探针法检测BRAF基因V600E突变阴性的病例进行BRAF基因测序,结果28例样本均未检测到BRAF基因突变(见图4),测序结果与PCR—荧光探针法检测结果一致。5、与PCR—荧光探针法比较,免疫组化法检测BRAFV600E(VE1)的灵敏度为100%(33/33),特异度为 42.86%(21/49)。(三)BRAF基因V600E突变与临床病理参数的关系PTC+HT组和PTC组BRAFV600E突变与否与患者年龄、性别、肿瘤大小、有无被膜侵犯及淋巴结转移等临床病理参数均无明确关系(P>0.05)。(四)淋巴细胞浸润情况PTC+HT、PTC HT三组病变中均可见数量不等的淋巴细胞浸润,其中HT组淋巴细胞浸润数量最多,PTC+HT组数量居中,PTC组淋巴细胞浸润数量较少。免疫组化染色结果显示浸润的淋巴细胞大部分为T淋巴细胞(CD3+),少量为B淋巴细胞(CD20+)。1、CD3+淋巴细胞数量三组间CD3+淋巴细胞数量以HT组最多,PTC+HT组次之,PTC组最少,差异有统计学意义(P<0.05)2、CD4+/CD8+淋巴细胞比值三组CD4+/CD8+淋巴细胞比值分别为PTC+HT组2.37±1.17,PTC组1.30±0.79,HT组0.81±0.67,三组间CD4+/CD8+淋巴细胞比值的差异均有统计学意义(P<0.05)。3、PTC+HT和PTC组织BRAFV600E是否突变与浸润CD2+淋巴细胞数量和CD4+/CD8+淋巴细胞比值无明确关系(P<0.05)。(五)甲状腺乳头状癌被膜侵犯组与被膜未侵犯组比较,前者肿瘤较大、淋巴结转移率高、BRAFV600E突变率高、浸润的CD3+淋巴细胞数量少、以及CD4+/CD8+淋巴细胞比值低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:1、与甲状腺乳头状癌相比较,伴桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌临床病理特征为:女性多见、肿瘤较小、BRAF基因V600E突变率低、肿瘤浸润T淋巴细胞数量多、CD4+/CD8+淋巴细胞比值较高;提示伴有桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌的预后优于甲状腺乳头状癌。2、伴桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌BRAFV600E突变率低,提示BRAF基因V600E突变并非伴桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌的主要基因突变形式。3、与无被膜侵犯的甲状腺乳头状癌相比较,有被膜侵犯的甲状腺乳头状癌BRAF基因V600E突变率较高,肿瘤浸润T淋巴细胞数量减少、CD4+/CD8+淋巴细胞比值下降;提示BRAF基因V600E突变、肿瘤组织内浸润的T淋巴细胞数量低、CD4+/CD8+比值下降是甲状腺乳头状癌预后不良的因素。4、免疫组化法可作为检测BRAFV600E突变的初筛方法,PCR-荧光探针法检测BRAFV600E突变的敏感性和特异性均高于免疫组化法。