第一部分:胆汁酸亚型生物标志物在良恶性胆道狭窄鉴别诊断中的作用研究研究背景:在术前不能确诊胆道狭窄的良恶性经常困扰着临床医师。即使结合多种诊断方法,一些病例仍不能确定病因。良恶性胆道狭窄的鉴别对后续临床治疗决策具有重大意义,尤其是在肝外胆管合并肿块的情况下。尽管大多数胆管狭窄是恶性的,主要原因是胰腺癌和胆管癌,但仍有高达30%的胆管狭窄是良性的。传统的鉴别手段,包括血液肿瘤标志物检测、CT或MRI等影像学检查、内镜超声和内镜逆行胰胆管造影活检、胆道镜活检,敏感性偏低,不能达到临床需求。此外,多达四分之一的疑似恶性狭窄,手术切除后确定为良性。必须平衡手术切除良性狭窄或错失切除潜在可治愈恶性肿瘤机会的风险。根据患者临床情况及其良恶性胆道狭窄的风险做出相应临床决策显得格外重要。研究目的:本部分研究旨在筛查可以用于良恶性胆道狭窄临床鉴别诊断的生物标志物,并组成联合标记套餐,提高诊断效能,并对诊断效能进行验证。研究方法:本研究分为生物标志物训练集和验证集两部分。训练集共收集了来自多中心的正常健康志愿者、良性和恶性胆道狭窄三组人群的血清样本,每组各30例,排除其他可能影响胆汁代谢的疾病或者药物使用者。验证集共收集来自多中心的上述三组人群血清样本,分别为20例、20例和27例,同样排除其他可能影响胆汁代谢的疾病或者药物使用者。采用高效液相色谱耦合串联质谱法（UPLC-MS/MS）对胆汁酸亚型进行定量分析。检测时遵循严格的分析质量控制程序,所有制备的样品在48小时内进行分析。采用三种类型的质量控制样本,即测试混合物、稳定同位素标记的内部标准和三种不同水平（低、中、高）的质量控制。在测试样品中添加了内部标准品,以监测整个样品制备和分析过程中的分析变化。试剂空白样品作为系统污染警报,也被用于洗涤柱和去除累积基质效应。校准品由空白样品（未经内部标准处理的基质样品）、零样品（用内部标准处理的基质样品）和一系列七种浓度样品组成。所有样本在检测时,均加入到Metabo-Profile LIMS系统中,并由LIMS分配一个唯一的标识符。仅有原始源标识符与该标识符关联,避免数据错配。利用 QuanMET 软件（v1.0,Metabo-Profi1e,上海,中国）对 UPLC-MS/MS 生成的原始数据文件进行处理,对每一种代谢产物进行峰积分、校准和定量。利用强大的R工作包来进行统计分析。采用SPSS22.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料采用t检验,非正态分布采用Mann-Whitney U检验;计数资料采用卡方检验或者Fisher确切检验法。如果疾病危险单因素分析时P＜0.05,则采用多因素logistic回归分析进一步分析,显著性检验水准为α=0.05。采用ROC曲线来评估候选分子诊断标志物的诊断效能,比较其曲线下面积AUC。利用随机森林法和支持向量法对上述方法检测到具有差异的生物标志物进行分析,筛选出临床鉴别效能更高的标志物,组成联合诊断因子。利用SPSS软件构建基于上述排名前四的差异胆汁酸亚型联合因子。读取Logsitic回归方程式,在SPSS中计算一个新变量-联合因子。利用新的联合因子数据勾画ROC曲线。对独立验证队列样本进行胆汁酸亚型定量检测。利用训练集获取的联合诊断标志物计算公式,计算验证集样本联合因子数值,推定其分属人群,计算新型联合诊断因子的特异性、敏感性、阴性预测值和阳性预测值。通过临床跟踪随访,分析CDCA、bCDCA和TCA三种具有鉴别意义的胆汁酸亚型和恶性胆道狭窄预后的关系,探讨其在预后判断中应用的可能性。研究结果:本研究训练集共有正常志愿者、良性胆道狭窄和恶性胆道狭窄三组,每组30例。验证集三类人群分别为20例、20例和27例。1.各组人群胆汁酸亚型聚类分析显示具有良好的聚类特征。2D-PLS-DA、3D-PLS-DA得分图、PCA分析和利用Z-score归一法对胆汁酸亚型绝对值进行转换后绘制的胆汁酸亚型热图均提示三组人群具有良好聚类特征。对三组人群进行两两数据聚类分析,同样显示良好聚类特征,其OPLS-DA分析Q2值分别为-0.259、-0.229和-0.503,均小于0,提示模型可信。2.各组人群胆汁酸亚型构成差异显著。火山图可以清楚显示两组间差异胆汁酸构成。基于单维和双维统计分析可以有效区分各组间有意义的差异胆汁酸。箱式图和小提琴图进行了直观的展示。其中正常人群与良性胆道狭窄共有11种差异胆汁酸,分别为bCDCA、bDCA、isoLCA、LCA、12ketoLCA、CDCA3Gln、GHCA、NorCA、THCA、DCA、和 HDCA,P＜0.01。正常人群与恶性胆道狭窄共有19种差异胆汁酸,分别为LCA、CDCA3Gln、bCDCA、DCA、bUDCA、12ketoLCA、CDCA、bDCA、THCA、NorCA、HDCA、TCDCA、GCDCA、TBA、7ketoLCA、GHCA、TCA、HCA 和 isoLCA,P＜0.01。良恶性胆道狭窄组共有 10 种差异胆汁酸,分别为 CDCA3Gln、HCA、TCA、7ketoLCA、HDCA、THCA、LCA、isoLCA、bCDCA和CDCA,P＜0.01。共有6种胆汁酸亚型在三组人群均具有显著差异,分别为 bCDCA、CDCA3Gln、HDCA、isoLCA、LCA 和 THCA,P＜0.01。3.差异胆汁酸亚型可以用于良恶性胆道狭窄鉴别。对于同时符合多维和单维筛选标准的差异胆汁酸亚型,绘制受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）,并计算 AUC 值。正常人群与良性胆道狭窄组,差异胆汁酸亚型的AUC最大为0.972,最小为0.723。通过随机森林法和支持向量机法共选取排名前4的差异胆汁酸作为联合诊断指标,分别为NorCA、bCDCA、DCA和THC。联合诊断指标的AUC=0.969。正常人群与恶性胆道狭窄组,差异胆汁酸亚型的AUC最大为0.999,最小为0.957。筛选出TCA、NorCA、bCDCA和bDCA组成联合诊断指标,其AUC=1.000。良恶性胆道狭窄两组生物标志物AUC最大为0.892,最小为0.733。筛选出bCDCA、CDCA、HCA、TCA 组成联合诊断指标,AUC=0.871。4.独立验证队列测试证实胆汁酸亚型联合诊断指标具有良好的良恶性胆道狭窄鉴别诊断效能多变量质量控制图显示验证队列胆汁酸定量检测数据稳定、可靠。验证队列与质控样本混杂检测,发现多数标本在2倍标准差之内围绕x轴上下波动,只有1例标本的点接近控制界限。质控样本间相关性热图显示各QC样本相关系数在0.985-1.000之间,说明数据稳定可靠。带有QC样本的PCA得分图,显示QC样本点彼此靠近、聚集程度较高,提示仪器检测具有良好的稳定性。有监督的PLS-DA分析显示验证队列中各组人群具有良好的聚类特征,与训练集类似,具有可比性。利用验证集数据,分析训练集建立的逻辑回归模型,对比其判断准确性,观测指标包括敏感性、特异性、阴性预测值和阳性预测值。良恶性胆道狭窄的鉴别时,其 AUC 值为 0.844（95%CI 0.729-0.960）,敏感性为 0.888,特异性为 0.650,阴性预测值为0.813,阳性预测值为0.774。在正常人群与良性胆道狭窄的鉴别时,其 AUC 值为 0.888（95%CI 0.784-0.981）,敏感性为 0.600,特异性为 0.950,阴性预测值为0.703,阳性预测值为0.923。在良性和恶性胆道狭窄的鉴别时,其AUC 值为 0.993（95%CI 0.978-1.000）,敏感性为 0.963,特异性为 0.950,阴性预测值为0.950,阳性预测值为0.963。5.部分胆汁酸亚型和恶性胆道狭窄预后有关。分析了 CDCA、bCDCA和TCA三种胆汁酸亚型与恶性胆道狭窄患者预后的关系。临界值选择依据良恶性胆道狭窄ROC曲线的最优界值,其中CDCA界值为20.38,bCDCA界值为1.195,TCA界值为2816。三种胆汁酸亚型均与恶性胆道狭窄的预后显著相关。其中 CDCA（16.57±3.40vs8.04±0.64,P＜0.01）和 bCDCA（16.37±2.97vs7.73± 0.59,P＜0.01）在界值以上的预后更佳,TCA在界值以上的预后较差（8.38±0.83vs13.89±2.90,P＜0.05）。结论及意义:胆汁酸亚型构成比在良恶性胆道狭窄患者中具有明显差异;CDCA、bCDCA、HCA、TCA等胆汁酸亚型可以作为其鉴别诊断的生物标志物,通过筛选组合而成的新标志物诊断效能更高,其ROC-AUC达到0.871,较传统生物标志物Ca19-9明显升高,可以作为术前诊断良恶性胆道狭窄的鉴别诊断手段之一。部分胆汁酸亚型,如CDCA、bCDCA和TCA,可能和恶性胆道狭窄预后有关。第二部分:胆汁酸合成和分泌信号通路改变在胆管癌胆汁酸代谢变化中的作用探索研究背景:胆管癌是较为常见的恶性胆道狭窄类型之一。根据第一部分结果提示胆汁酸亚型可以作为良恶性胆道狭窄的生物标志物,多种亚型组合作为联合诊断指标后其诊断效能更高。前期研究表明,胆汁酸代谢改变在胆管癌发生中具有重要作用,影像胆汁酸代谢的主要通路包括胆汁酸合成和胆汁酸的分泌,但其具体机制不明。研究目的:初步探索胆汁酸合成和分泌信号通路改变在胆管胆汁酸代谢变化中的作用。研究方法:1.对比胆管癌和非胆管癌志愿者病例血清胆汁酸亚型构成收集胆管癌和非胆管癌志愿者（良性胆道疾病或正常志愿者）废弃血清标本各20例,采用UPLC-MS/MS系统对胆汁酸亚型进行定量检测,并对比两组不同。2.生物信息学方法筛查与胆汁酸代谢有关的信号通路变化利用TCGA数据库,分析恶性梗阻性黄疸中最常见类型-胆管癌与正常人群胆汁酸差异的原因。使用R软件的Limma软件包（版本:3.40.2）研究mRNA的差异表达。在TCGA中分析调整后的P值以纠正假阳性结果。“校准P＜0.05且|log2（FC）|＞1”被定义为mRNA差异表达的筛选阈值。利用R中的Cluster Profiler程序包分析潜在mRNA的GO功能并丰富KEGG途径,探讨胆管癌与正常人群差异基因参与的信号通路。3.建立人肝外胆管细胞体外上皮间质转化模型,并验证其肿瘤生物学行为。利用人原代肝外胆管上皮细胞系,通过1Ong/ml（B）、20ng/ml（C）和40ng/ml（D）梯度浓度TGF-β 1刺激后,建立人肝外胆管上皮细胞上皮间质转化细胞模型（EMT）。与正常对照组（A）对比,观察不同组别细胞形态学变化、利用Transwell实验、划痕实验验证EMT后细胞转移和迁徙能力、利用荧光定量检测方法检测EMT生物标志物、流式细胞法检测细胞周期改变。4.利用代谢组学和转录组学方法,验证胆汁酸代谢及胆汁酸合成信号通路改变是否参与胆管癌胆汁酸代谢改变。将各组EMT转化后的人肝外胆管上皮细胞,利用LC-MS/MS进行代谢组学检测、Ilumina测序平台进行转录组学检测。对比分析各组代谢产物和信号通路是否产生和临床标本、生信分析相类似的改变,验证胆汁酸亚型在胆管癌鉴别诊断中的作用,以及初级胆汁酸合成和胆汁分泌信号通路改变在胆管癌胆汁酸亚型代谢改变中的作用。研究结果:1.胆管癌患者与非肿瘤志愿者部分胆汁酸亚型水平具有显著差异。在胆管癌与非肿瘤志愿者血清中,共有15种胆汁酸亚型表达差异具有显著统计学意义,其中TBA、THCA、TCA、NorCA和CDCA3Gln表达显著下降,isoLCA、LCA、DCA、7ketoLCA、CDCA、HDCA、bUDCA、bCDCA、bDCA和HCA表达上升。2.生信分析提示胆汁酸合成和分泌异常可能是造成胆管癌与正常人群胆汁酸代谢差异的原因。获取2020年1月版36例胆管癌和9例癌旁组织TCGA基因表达。当logFC≥1/≤-1,P＜0.05,校准P＜0.01时,9887个差异基因符合标准。火山图和热图均显示有良好基因聚类特征。对差异基因的富集分析显示有20条KEGG通路,包括初级胆汁酸的生物合成和胆汁分泌,二者均下调。胆管癌与癌旁组织中,初级胆汁酸合成信号通路下调,共有12个基因表达下调,包括 CYP7A1、ACOX2、CYP39A1、AKR1C4、AK1D1、CYP27A1、BAAT、CYP8B1、HSD17B4、SCP2 和 SLC27A5。只有 HSD3B7 和 ACOT8 上调。胆管癌胆汁分泌信号通路表达整体下调,但其中胆汁重吸收作用显著增加。胆汁分泌信号通路中有11个基因表达上调,包括GNAS、SLC4A2、ABCC3、ADCY6、SLC9A1、ABCC4、CFTR、SLC2A1、AQP1、SCTR 和 SLC10A2,主要参与胆汁中HCO3-、水的分泌和胆汁酸、葡萄糖等物质重吸收;有12个基因表达下调,包括 SLC10A1、SLC22A7、SLCO1B1、ABCG8、SLCO1B3、ABCB4、ABCG5、ABCB11、KCNN2、ABCC2、EPHX1 和 ABCG2,主要参与胆汁分泌和重吸收。3.TGF-β 1刺激后可使人肝外胆管上皮细胞发生上皮间质转化（EMT）,并具有稳定肿瘤生物学行为。TGF-β 1刺激后,人肝外胆管上皮细胞镜下形态异型性增加,细胞间松散,部分细胞出现悬浮生长。在Transwell实验中,随着TGF-β 1刺激浓度的提高,人肝外胆管上皮细胞的迁移数量显著增加。空白对照组（A）、10ng/ml（B）、20ng/ml（C）和40 ng/ml（D）TGF-β 1组,三个200倍视野下迁移数量分别为38.3±8.4、40.3±1.2、54.0±1.0和62.3±3.2。与A组相比,B组迁移数量略增加,但差异无统计学意义,C和D组迁移数量显著增加,差异具有统计学差异,P值分别为0.03和0.01。在细胞划痕实验中,随着TGF-β 1刺激浓度的提高,人肝外胆管上皮细胞的迁移率显著增加。A、B、C、D四组在24h时与0h的划痕宽度比值分别为0.7722、0.7483、0.6861和0.4974,48h时与0h的划痕宽度比值分别为0.4896、0.4798、0.4157和0.2562。与A相比,B组划痕宽度缩小不明显,无统计学差异,C和D组划痕宽度缩小显著,具有显著差异,P＜0.05。相对荧光定量检测显示,与A组相比,各组α-SMA和Fibronectin表达显著增加,E-cadherin下降明显,均具有统计学差异,P＜0.05,且不呈现TGF-β1剂量依赖性。Vimentin变化虽略有增加,但不具有统计学意义,P＞0.05。在Western blot实验中,同样可以观察到类似结果。流式细胞测定显示,各组凋亡细胞占比无显著变化,P＞0.05。4.EMT的胆管上皮细胞,胆汁酸代谢和胆汁酸合成信号通路发生同步改变。代谢差异物火山图及层次聚类分析热力图显示,各组间代谢产物具有显著差异且具有良好聚类特征。将各组代谢组学检测的胆汁酸亚型数据进行对比,发现TCA、THCA显著下降,7-ketoLCA、DCA和LCA显著增加,与临床标本信息一致,说明人肝外胆管上皮细胞EMT后具有与胆管癌类似的胆汁酸代谢特点。KEGG通路差异丰度分析显示胆管上皮细胞EMT转化后胆汁分泌信号通路上调,但这种上调并不随TGF-β 1的浓度增加而变强。这与前期通过生信分析得到的Bile secretion信号通路整体下调,但在胆管上皮细胞层面的无机盐分泌增加、胆汁酸重吸收作用增强相吻合。差异代谢物的代谢通路富集分析显示,在低浓度TGF-β 1刺激后初级胆汁酸合成信号通路即发生改变,但随着浓度的增加,该信号通路并没有显示出更大的差异性。各组样本检测基因表达量趋于饱和,不再随数据量增加而增加,说明检测结果可靠。采用DESeq筛选差异表达基因,条件为|log2FoldChange|＞1,P＜0.05。结果显示相对于A组,各组基因表达均有显著变化,但组间差异表达相对较少。火山图及层次聚类分析显示各组细胞具有显著差异,且有良好的聚类特征。将各组样本Read Count采用FPKM法进行标准化。依据KEGG信号通路图,分析并对比各组初级胆汁酸合成和胆汁分泌信号通路中的差异基因。在初级胆汁酸合成信号通路中,ACOX2和HSD17B4表达下调。在胆汁分泌信号通路中,ABCC2、ABCG2、EPHX1 表达下调,ADCY3、SLC2A1、GNAS 和 AQP1 表达上调,与前面生信分析结果类似。研究结论:胆管癌和非胆管癌志愿者胆汁酸代谢具有显著差异;和癌旁组织相比,胆管癌初级胆汁酸合成和胆汁酸分泌信号通路显著下调;TGF-β1可使人肝外胆管细胞发生稳定的上皮间质转化;EMT的胆管上皮细胞胆汁酸代谢、初级胆汁酸合成和胆汁酸分泌信号通路发生和临床标本类似的变化;初级胆汁酸合成和胆汁酸分泌信号通路异常可能是胆管癌胆汁酸代谢改变的原因,可为以后胆管癌发病机制研究和靶向胆汁酸代谢的药物治疗提供方向。