【摘 要】
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背景:喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤,死亡率高且极具侵袭性,目前影响喉癌的分子机制尚未系统性的阐述清晰,NK4作为肝细胞生长因子（HGF）拮抗剂,不仅发挥抑制HGF/c-Met诱导的肿瘤的生长、转移和侵袭拮抗剂的作用,还可以抑制不依赖于HGF/c-Met途径的血管生长因子（VEGF、b FGF）诱导的肿瘤血管生成,最终导致肿瘤细胞凋亡。目前尚未有研究证实NK4基因在喉癌中的作用以及通过哪种机制发挥生
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背景:喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤,死亡率高且极具侵袭性,目前影响喉癌的分子机制尚未系统性的阐述清晰,NK4作为肝细胞生长因子（HGF）拮抗剂,不仅发挥抑制HGF/c-Met诱导的肿瘤的生长、转移和侵袭拮抗剂的作用,还可以抑制不依赖于HGF/c-Met途径的血管生长因子（VEGF、b FGF）诱导的肿瘤血管生成,最终导致肿瘤细胞凋亡。目前尚未有研究证实NK4基因在喉癌中的作用以及通过哪种机制发挥生物学效应,喉癌的发生与多种信号转导通路失调密切相关,经研究证实Wnt/β-Catenin信号转导通路是喉癌中最常见的失调信号通路之一,Wnt/β-Catenin信号的异常活化与喉癌起始、发展、侵袭、转移和复发密切相关。目的:探讨NK4基因对喉癌AMC-HN-8细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、细胞周期及对裸鼠成瘤的影响及相关机制。方法:采用携带NK4基因的减毒沙门氏菌转染喉癌AMC-HN-8细胞,通过实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测NK4在AMC-HN-8细胞中的表达情况;采用MTT法、细胞划痕实验、Transwell法、流式细胞术检测NK4基因对喉癌AMC-HN-8细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及细胞周期的影响;通过裸鼠成瘤模型评估NK4基因对AMC-HN-8细胞体内生长的影响;肿瘤组织利用HE染色观察状态,同时利用蛋白印迹法（Western blotting）和免疫组化检测移植瘤组织中DKK1、Wnt1和β-Catenin蛋白的表达。结果:经转染后细胞形态和数量发生变化;q RT-PCR结果显示转染组较对照组NK4的表达显著提高（P＜0.01）,且表达量随转染时间增加;MTT结果显示NK4高表达会抑制AMC-HN-8细胞的增殖能力（P＜0.01）,加入30%表达上清时抑制活性不再随剂量加大而增加;划痕及Transwell侵袭实验结果显示细胞迁移能力下降（P＜0.01）,NK4抑制喉癌细胞侵袭;Annexin V/PI双染实验检测结果显示NK4基因诱导AMC-HN-8细胞凋亡增加（P＜0.01）,转染48h后,转染组G1和G2/M期所占比例低于对照组,S期细胞所占比例高于对照组,诱导细胞周期发生S期阻滞（P＜0.01）;裸鼠皮下成瘤实验证明NK4高表达后AMC-HN-8细胞成瘤能力减弱（P＜0.01）;WB检测显示治疗组NK4高表达后DKK1蛋白表达增高,而Wnt1和β-Catenin蛋白对比于对照组,表达降低;HE染色结果示对照组中鳞状细胞癌细胞呈巢团状分布,细胞核大深染,分裂像易见;治疗组中癌组织大部分坏死,仅残留少许癌细胞,部分癌细胞有退变;免疫组化检测示对照组癌细胞低表达NK4,治疗组NK4表达增高,部分癌细胞内无明显表达,DKK1相较于对照组,在治疗组表达增高,β-Catenin蛋白相较于对照组表达降低。结论:减毒沙门氏菌携带的NK4基因可抑制喉癌AMC-HN-8细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡,并能抑制AMC-HN-8细胞在裸鼠体内的成瘤能力。NK4的抗喉癌作用机制可能与其参与调控DKK1/Wnt/β-Catenin信号通路有关。
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