论文部分内容阅读
背景:卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)又称为人疱疹病毒8型,是卡波氏肉瘤(KS)的病原。KSHV感染后在体内有潜伏感染(latent)和裂解激活(lytic)两种状态。潜伏相关核抗原(LANA)是维持KSHV潜伏感染的关键因子,在KSHV感染的细胞中持续表达。复制与转录激活因子(RTA)是KSHV裂解复制的“开关”分子,仅在病毒初始感染(de novo infection)和裂解复制时表达。重组信号序列结合蛋白J kappa(RBPJ)在KSHV复制调控方面呈现双重效应,与LANA或RTA结合分别发挥维持潜伏感染和促进裂解复制的功能,但RBPJ维持潜伏感染和促进裂解复制功能相互转变的机制尚不完全清楚。RTA和LANA启动子上均有RBPJ结合元件,而我们前期研究发现LANA通过let-7a/RBPJ信号调控KSHV潜伏感染;RTA下调Let-7a,上调RBPJ。提示let-7a/RBPJ信号受RTA和LANA的双重调控,并因此影响RTA和LANA自身的表达来控制KSHV潜伏和裂解复制的转变。目的:明确RTA、LANA对let-7a/RBPJ信号共调控作用,RBPJ在RTA和LANA相互调控对方启动子活性中的作用及其在KSHV复制状态转变中发挥的作用。方法:首先采用过表达和RNA干扰技术检测RTA对let-7a/RBPJ信号通路分子表达水平的影响:脂质体法转染RTA质粒到293T细胞,以转染相应空载体为对照,实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPCR)检测let-7a、p65、Lin28B和RBPJ的转录水平,western-blot检测Lin28B、p65和RBPJ的蛋白水平;脂质体法转染RTA的特异性siRNA到iSLK-RTA细胞,以转染非特异siRNA为对照,检测上述指标。然后,采用qPCR检测在KSHV病毒子初始感染HMEC-1细胞过程中LANA、RTA、let-7a和RBPJ表达的动态变化及western-blot检测RBPJ的蛋白水平。接着,用多西环素激活iSLK-219细胞,采用qPCR和western-blot技术检测KSHV激活过程中RTA和LANA表达的动态变化及let-7a、RBPJ的表达情况。进一步,利用脂质体转染技术将不同比例的RTA、LANA表达载体转染至293T细胞中,采用qPCR技术检测let-7a、RBPJ的转录水平,western-blot检测RBPJ、LANA、RTA的蛋白水平。最后,采用双荧光素酶报告基因检测系统分别检测RBPJ在RTA调控LANA启动子活性及LANA调控RTA启动子活性中的作用。结果:1.过表达RTA上调p65、Lin28B,下调let-7a,同时促进RBPJ表达;下调RTA则反之。2.KSHV从初始感染(de novo infection)到潜伏状态(latent status)的建立过程中,RTA的表达逐步下降而LANA的表达逐步升高,let-7a的表达先上升后下降,RBPJ的表达水平变化趋向与let-7a相反。3.在KSHV裂解复制时,RTA表达水平急剧增加,LANA表达水平也有所增加,同时RBPJ的表达水平增加而let-7a相反。4.let-7a/RBPJ信号通路的方向受RTA和LANA的相对量控制。5.敲低RBPJ时,减弱了RTA对LANA启动子的激活作用,减弱了LANA对RTA启动子的抑制作用。结论:1.let-7a/RBPJ信号受到RTA和LANA的双重调控,二者对let-7a/RBPJ调控的方向相反。RTA可能通过NF-κB/Lin28B抑制let-7a进而促进RBPJ的表达。2.RBPJ在RTA和LANA相互调控对方启动子的转录活性中起着重要作用。3.RTA和LANA竞争调控let-7a/RBPJ信号,而RBPJ反过来调控RTA和LANA的表达,由此形成的耦合反馈调控环路在KSHV调控复制状态转变中发挥重要作用。研究的理论与实际意义:RTA、LANA通过共调控let-7a/RBPJ信号,并通过该信号反过来相互调控对方的表达,由此在控制KSHV潜伏感染的建立及裂解复制中发挥重要作用。本研究丰富了RTA、LANA调控KSHV复制的机制。