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背景:肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）被报道是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一,其发病率还在逐年上升。现有治疗方法主要包括手术切除,肝移植,射频消融,化学栓塞和多激酶抑制剂。然而,由于其高复发及转移率,HCC通常预后不良。肝癌中存在一小群具有自我更新能力特征的肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）,与非肿瘤干细胞（Non-cancer stem cells,NCSCs）相比容易对肿瘤治疗产生抵抗,是肝癌复发、转移和化疗耐药的根源。研究肝癌干细胞自我更新的机制,从而找到杀伤干细胞的靶点,阻断肝癌复发和耐药,对于提高肝癌治疗效果具有重要意义。大量文献报道,钙离子(Calcium,Ca2+)的代谢在细胞中参与多种生理活动,其中非兴奋性细胞Ca2+内流的主要途径——钙库操控的Ca2+内流(Store-operated Ca2+entry,SOCE),对HCC的发生、发展及转移等过程发挥重要作用。SOCE介导的Ca2+内流可通过活化T细胞核因子（Nuclear factor of activated T cells,NFAT）等转录因子,调控下游基因表达。而SOCE是否参与到CSCs的自我更新尚无相关报道。成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,FGF）在多个器官调节多种生理活动,其中分泌型FGF家族中FGF19在胆汁酸、葡萄糖和脂质代谢的稳态中发挥重要作用。在HCC中,FGF19表达上调并与患者的不良预后呈正相关。FGFR4是主要表达在肝细胞膜上的FGF19受体,且有文献报道FGF19/FGFR4与胚胎细胞干性维持相关。目前,临床前证据表明,FGF19/FGFR4激活是HCC的驱动因素,而FGFR4抑制剂抑制了肝癌的发生。FGF19/FGFR4通路可导致Ras-Raf-ERK1/2-MAPK和PI3K/AKT的激活,促进HCC的增殖。同时,FGF19可以激活其它生长因子,如结缔组织生长因子和EGFR配体双调蛋白的表达,增强HCC的发生发展。然而,目前尚不清楚FGF19/FGFR4是否与肿瘤干细胞有关。基于以上研究背景,我们推测FGF19/FGFR4可能与肝癌干细胞的自我更新特性有关。研究方法:1.干预FGF19的表达对CSCs自我更新特征的影响。1.1无血清诱导法富集人CSCs;1.2 RT-q PCR检测CSCs与NCSCs中干性基因和成熟肝细胞基因表达水平,CSCs与NCSCs中FGF19基因表达水平,敲降FGF19的CSCs中干性基因和成熟肝细胞基因表达水平,过表达FGF19同时敲除FGFR4的NCSCs中干性基因和成熟肝细胞基因表达水平,使用FGFR4抑制剂后FGF19处理的NCSCs中干性基因和成熟肝细胞基因表达水平;1.3成球实验检测CSCs与NCSCs自我更新能力,敲降FGF19的CSCs自我更新能力,过表达FGF19同时敲除FGFR4的NCSCs中自我更新能力,使用FGFR4抑制剂后FGF19处理的NCSCs中自我更新能力;1.4克隆形成实验检测CSCs与NCSCs自我更新能力,敲降FGF19的CSCs自我更新能力,过表达FGF19同时敲除FGFR4的NCSCs中自我更新能力,使用FGFR4抑制剂后FGF19处理的NCSCs中自我更新能力;1.5 CCK-8试剂盒检测CSCs与NCSCs对索拉非尼的耐药性,敲降FGF19的CSCs对索拉非尼的耐药性,过表达FGF19同时敲除FGFR4的NCSCs对索拉非尼的耐药性,使用FGFR4抑制剂后FGF19处理的NCSCs对索拉非尼的耐药性;1.6裸鼠成瘤实验检测CSCs与NCSCs自我更新能力,敲降FGF19的CSCs自我更新能力,过表达FGF19同时敲除FGFR4的NCSCs中自我更新能力,使用FGFR4抑制剂后FGF19处理的NCSCs中自我更新能力;1.7 Western Blot检测CSCs与NCSCs中FGF19蛋白表达水平,CSCs分化过程中FGF19与干性相关蛋白表达水平,敲降FGF19的CSCs中自我更新和成熟肝细胞蛋白表达水平,过表达FGF19同时敲除FGFR4的NCSCs中自我更新和成熟肝细胞蛋白表达水平,使用FGFR4抑制剂后FGF19处理的NCSCs中自我更新和成熟肝细胞蛋白水平;1.8 Elisa实验检测CSCs与NCSCs的FGF19分泌量;1.9免疫组化检测裸鼠CSCs与NCSCs移植瘤中FGF19的表达差异,临床肝癌组织样本FGF19与Nanog、Oct-4和ALB蛋白表达的关系2.FGF19激活SOCE对NCSCs自我更新特征的影响。2.1成球实验检测使用SOCE抑制剂后CSCs的自我更新能力,使用SOCE抑制剂后用FGF19处理NCSCs自我更新能力;2.2克隆形成实验检测使用SOCE抑制剂后CSCs的自我更新能力,使用SOCE抑制剂后用FGF19处理NCSCs自我更新能力;2.3 RT-q PCR检测使用SOCE抑制剂后CSCs自我更新和成熟肝细胞相关基因的表达,使用SOCE抑制剂和FGF19处理后NCSCs自我更新和成熟肝细胞相关基因的表达,FGF19处理后NCSCs中SOCE相关基因表达;2.4钙成像技术检测使用SOCE抑制剂对NCSCs钙内流的影响,3-NC、LY3214996、FGF19处理后NCSCs钙内流的变化;2.5 CCK-8试剂盒检测使用SOCE抑制剂和FGF19处理后NCSCs对索拉菲尼耐受性的影响;2.6 Western Blot检测使用SOCE抑制剂和FGF19处理后NCSCs自我更新和成熟肝细胞蛋白表达水平,FGF19处理后NCSCs中SOCE相关蛋白表达,BLU9931、3-NC、LY3214996、FGF19处理后PLCγ和细胞外调节蛋白激酶1/2（Extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2）通路蛋白表达;2.7激光共聚焦观察BLU9931、3-NC、LY3214996、FGF19处理后STIM1蛋白寡聚化光斑。3.NFATc2在FGF19促进NCSCs自我更新特征中的作用。3.1双荧光素酶报告实验检测FGF19激活NFAT亚型,NFAT与FGF19启动子上的反应原件结合情况;3.2在NCSCs中分别敲降4个NFAT亚型;3.3基因富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）分析NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4在HCC中的作用;3.4 TCGA数据库中HCC患者NFATc2表达与总生存期的Kaplan-Meier分析3.5 Western Blot检测核内、胞浆以及总蛋白中NFATc2的表达,敲除NFATc2以及FGF19处理后自我更新和成熟肝细胞相关蛋白表达,CSCs与NCSCs中NFATc2在胞浆和核内的表达,NCSCs中敲除NFATc2后FGF19的蛋白表达,NCSCs中过表达NFATc2后FGF19的蛋白表达,;3.6激光共聚焦检测NCSCs中使用BLU9931、3-NC、LY3214996、SKF96365和FK506处理后FGF19处理后NFATc2（绿色）的亚细胞定位,DAPI（蓝色）标记细胞核;3.7 RT-q PCR检测NCSCs敲除NFATc2以及FGF19处理后干性基因和成熟肝细胞相关基因的表达,CSCs与NCSCs中敲除NFATc2后FGF19的基因表达,NCSCs中过表达NFATc2后FGF19的基因表达;3.8成球实验检测NCSCs敲除NFATc2以及使用FGF19诱导后的自我更新能力;3.9克隆形成实验检测NCSCs敲除NFATc2以及使用FGF19诱导后自我更新能力;3.10 CCK-8试剂盒检测NCSCs敲除NFATc2以及使用FGF19诱导后对索拉菲尼耐受性的影响;3.11免疫组化检测NFATc2与FGF19表达的相对关系;3.12染色质免疫共沉淀检测NFATc2和FGF19启动子上反应原件的结合情况;3.13 FGF19启动子序列Cp G岛预测。4靶向FGF19/NFATc2通路对CSCs自我更新特征的影响。4.1 Kaplan-Meier分析TCGA数据库（n=365）FGF19和NFATc2表达与HCC患者总生存期的相关性4.2 RT-q PCR检测CSCs敲减FGF19以及NFATc2后自我更新和成熟肝细胞相关基因的表达;4.3 Western Blot检测CSCs敲减FGF19以及NFATc2后自我更新和成熟肝细胞相关蛋白的表达;4.4成球实验检测CSCs敲减FGF19以及NFATc2后自我更新能力,联合使用BLU9931、FK506对LCSC后自我更新能力;4.5克隆形成实验检测CSCs敲减FGF19以及NFATc2后自我更新能力,联合使用BLU9931、FK506对LCSC后自我更新能力;4.6裸鼠成瘤实验检测CSCs敲减FGF19以及NFATc2后自我更新能力,联合使用BLU9931、FK506对LCSC后自我更新能力;4.7裸鼠原位荷瘤实验检测CSCs敲减FGF19以及NFATc2后裸鼠总体生存期。研究结果:1.FGF19增强NCSCs自我更新能力我们使用无血清诱导法富集了肝癌细胞球,与贴壁细胞相比其干性基因表达显著上调,成熟肝细胞标志物基因表达下调。且平板克隆率、细胞成球率以及裸鼠成瘤率均显著增加,对索拉非尼的耐药性增强。因此,我们使用无血清诱导法富集CSCs模型成功。我们检测发现,CSCs中FGF19表达水平及分泌量显著高于NCSCs,且敲降FGF19下调CSCs的干性基因和蛋白的表达。敲降FGF19的CSCs平板克隆率、细胞成球率以及裸鼠成瘤率均显著减弱,对索拉非尼的耐药性减弱。在NCSCs中过表达FGF19上调了其干性基因和蛋白的表达,并且平板克隆率、细胞成球率以及裸鼠成瘤率增加,对索拉非尼的耐药性增强。而同时在过表达FGF19的NCSCs中敲除FGFR4,以上自我更新特征的变化消失。使用FGF19处理NCSCs促进其干性基因和蛋白的表达,并且平板克隆率、细胞成球率以及裸鼠成瘤率增加,对索拉非尼的耐药性增强,而同时联用FGFR4抑制剂BLU9931消除了以上FGF19的作用。2.FGF19激活SOCE增强NCSCs自我更新能力:我们使用SOCE抑制剂SKF-96365刺激CSCs,发现其干性基因表达水平下调,平板克隆率、细胞成球率均显著减少。相应的,使用FGF19刺激NCSCs增强其Ca2+内流,此变化可被SKF-96365抑制。联合使用FGF19与SKF-96365,NCSCs的干性基因和蛋白的表达显著低于FGF19单独处理组,平板克隆率、细胞成球率以及裸鼠成瘤率、对索拉非尼的耐药性均低于FGF19单独处理组。使用FGF19刺激NCSCs未明显改变STIM1、STIM2、Orai1基因和蛋白的表达,而上调了磷酸化PLCγ和ERK1/2的蛋白表达。使用PLCγ的抑制剂3-NC,ERK1/2的抑制剂LY3214996下调磷酸化PLCγ和ERK1/2的蛋白表达,以及FGF19诱导的NCSCs Ca2+内流的增加。使用FGF19刺激NCSCs可观察到STIM1的寡聚化斑点增多,使用BLU9931、3-NC、LY3214996减少STIM1寡聚化斑点的数量,而联用3-NC和LY3214996对STIM1的寡聚化抑制效果最强。3.FGF19/SOCE促进NFATc2去磷酸化并核转位上调NCSCs干性基因及FGF19基因表达:通过荧光素酶实验我们发现,FGF19可以促进NFATc2与NFAT反应元件结合。此外,我们通过富集分析发现,NFATc2与干细胞未分化状态相关,而其他NFAT亚型无相关通路富集。生物信息学分析发现,NFATc2高表达患者总体生存期更短。我们使用FGF19刺激Huh7 NCSCs发现细胞中p-NFATc2蛋白水平减少,核内NFATc2蛋白增多,而使用BLU9931、3-NC、LY3214996、SKF-96365、FK506均可抑制NFATc2在核内的增多。我们通过激光共聚焦实验发现FGF19促进NFATc2发生核转位,并且此现象可被BLU9931、3-NC、LY3214996、SKF-96365、FK506抑制。敲减NFATc2消除了FGF19诱导的NCSCs干性基因、蛋白表达上调以及平板克隆率、细胞成球率以及对索拉非尼的耐药性的增强。我们发现CSCs中NFATc2在核内的表达水平也高于胞浆,且敲降NFATc2下调了CSCs中FGF19的基因和蛋白表达,而在NCSCs中过表达NFATc2上调FGF19的基因和蛋白表达。HCC临床样本免疫组化结果显示,NFATc2与FGF19表达呈正相关。生物信息学分析发现,FGF19启动子序列包含四个NFAT反应元件,通过荧光素酶实验以及Ch IP实验我们发现,NFATc2通过作用在第四位反应元件上激活FGF19启动子。我们通过Cp G岛分析发现第四位反应元件位于FGF19启动子非甲基化序列。4.靶向FGF19/NFATc2通路抑制CSCs自我更新;生物信息学分析发现FGF19与NFATc2同时低表达患者比FGF19、NFATc2高表达的患者总生存期更长。双敲降FGF19、NFATc2下调了CSCs干性基因与蛋白的表达,降低了CSCs平板克隆率、细胞成球率以及裸鼠成瘤率,且荷瘤裸鼠生存期延长。我们使用BLU9931以及FK506降低了CSCs平板克隆率、细胞成球率、裸鼠成瘤率以及对索拉非尼的耐药性。研究结论:我们发现CSCs中FGF19表达上调,FGF19通过结合FGFR4激活PLCγ与ERK1/2通路,增强SOCE水平,介导Ca2+内流。NFATc2在Ca N（Calcineurin,钙调磷酸酶）的作用下去磷酸化并发生核转位,上调干性基因以及FGF19的转录表达,形成促进自我更新的正反馈信号环路。靶向抑制FGF19以及NFATc2通路减弱CSCs自我更新特性。