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β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是一种能够随机切割甘露聚糖内部β-1,4糖苷键的半纤维素水解酶,已广泛应用于食品、药品、造纸和饲料等众多行业。而商品化的β-甘露聚糖酶仍存在耐受性差和催化活性低等缺陷,开发性状优良的β-甘露聚糖酶成为当务之急。以宇佐美曲霉E001总RNA为模板,采用反转录RT-PCR和巢式PCR技术扩增出β-甘露聚糖酶成熟肽的编码基因(Auman26A),其序列全长为954 bp,编码317个氨基酸。利用SalⅠ线性化表达质粒p PIC9KM-Auman26A后,电击转化毕赤酵母GS115。经G418筛选获得一株产酶活力最高的重组酵母GS115/Auman26A,经甲醇诱导表达,重组β-甘露聚糖酶(re Au Man26A)粗酶液对角豆胶的酶活性为481.9 U/m L。利用超滤和Sephadex G-75凝胶过滤层析对re Au Man26A的粗酶液进行分离纯化,比酶活为2717.6 U/mg。SDS-PAGE分析显示,re Au Man26A在高于理论值36.1 k Da的位置(66.4-97.2 k Da)呈现弥散且不均一的条带。酶学性质显示:re Au Man26A的最适温度为40℃,在80℃和90℃保温60 min后残余酶活性分别为53.8%和33.1%,表明re Au Man26A具有良好的热稳定性;其最适p H为5.5,在p H 5.0-7.0范围内保持稳定;EDTA、Fe2+和Fe3+对酶活性有激活或抑制作用,残余酶活性分别为100.8%、54.7%和39.8%,而其他金属离子对酶活性的影响不明显;re Au Man26A对角豆胶、魔芋粉和瓜尔豆胶的相对酶活性分别为100.0%、56.4%和28.5%,而对可溶性淀粉、桦木木聚糖和CMC-Na无催化活性;re Au Man26A对角豆胶的Km和Vmax值分别为15.25 mg/m L和7841.9 U/mg。经生物信息学分析可知,Au Man26A有四个潜在的N-糖基化位点:Asn3-Gln4-Thr5、Asn124-Val125-Ser126、Asn134-Gly135-Thr136和Asn305-Asp306-Thr307。通过定点突变分别构建去糖基化突变酶N3E、N124D、N134Q、N305Q及全突变酶NA。纯化后单点突变酶的比酶活分别为2082.9、2709.7、1367.0和2638.2 U/mg,含糖量分别为27.4%、23.7%、19.3%和29.2%,而全突变酶NA未检测到酶活性。SDS-PAGE显示:除N305Q外,去糖基化突变酶的弥散程度和蛋白分子量均有不同程度的降低,其中N134Q的弥散程度和条带大小较原酶降低最为明显。综上推测,Asn3-Gln4-Thr5和Asn124-Val125-Ser126发生了较低程度的糖基化修饰,Asn134-Gly135-Thr136的糖基化修饰程度最高,而Asn305-Asp306-Thr307未发生糖基化修饰。另外,N3E、N124D、N134Q、N305Q和原酶在90℃的半衰期t1/290分别为10.5、20.0、9.0、21.5和20.0 min,表明Asn3-Gln4-Thr5和Asn134-Gly135-Thr136糖基化位点对维持re Au Man26A的热稳定性起着重要的作用。以魔芋粉为底物,采用重组酶re Au Man26A酶法制备低聚葡甘露聚糖(GMOS)。以底物魔芋粉的水解率为指标,通过单因素试验确定酶法制备低聚葡甘露糖的酶解条件如下:加酶量60 U/(g魔芋粉),酶解温度40℃,魔芋粉浓度30 g/L,酶解时间5 h。在优化条件下进行酶解反应,测得魔芋粉水解率和酶解液还原糖浓度分别为53.3%和10.45 mg/m L。超滤后的酶解产物经高效液相色谱检测可知,组分主要以低聚葡甘露聚糖为主,其中还原性单糖含量占9.83%,二糖以上的低聚葡甘露糖占90.17%。本研究首次从宇佐美曲霉中克隆并异源表达出GH 26家族β-甘露聚糖酶基因,并探讨了糖基化位点对β-甘露聚糖酶性质的影响,迄今国内外文献未见有报道。