第一部分不同系统下NeuroD1介导的体内原位胶质细胞重编程的差异性研究背景:体内胶质细胞重编程是以大脑内源性胶质细胞为原材料、通过表达重编程因子而直接将胶质细胞原位重编程为功能性新神经元的一项新技术。利用该技术有望弥补因疾病而丢失的神经元,修复神经环路,最终实现功能性改善。随着其不断发展优化,该技术将在神经损伤和神经退行性疾病的治疗领域中展现出强大的应用潜力。为了在胶质细胞中特异性地过表达重编程转录因子以达到原位神经再生的目的,目前已经有多种病毒载体和转基因动物模型系统用于相关研究中。然而,尚未有直接的研究探讨不同表达系统介导的体内胶质细胞重编程的特点和差异。我们前期的研究证明神经分化因子1（Neurogenic differentiation 1,NeuroD1）可将大脑内的星形胶质细胞转变为功能性神经元,具有高效的重编程能力。另外,海马下托（subiculum,SUB）是海马和皮层神经通讯的枢纽区域,与学习记忆密切相关。研究表明5xFAD模型小鼠大脑内的SUB区是最早出现Aβ异常沉积和神经元丢失的部位。因此SUB区是研究体内原位胶质细胞重编程治疗5xFAD模型小鼠的理想场所。本研究将以NeuroD1为核心转录因子,SUB区为体内原位重编程部位,在不同的过表达系统中,研究NeuroD1介导的体内星形胶质细胞重编程的特点。该部分研究将为后期开发一套高效的原位神经再生技术提供参考,并为进一步的临床干预治疗阿尔茨海默病提供优化方案。目的:本研究将在由腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体和转基因小鼠组合而成的4种常用系统（AAV-FLEx+AAV-GFAP::Cre系统、AAV-GFAP::Neur D1系统、AAV-FLEx+GFAP::Cre转基因小鼠系统和AAV-FLEx+Aldh1l1::Cre/ER2转基因小鼠系统）中,比较NeuroD1介导的体内星形胶质细胞重编程的差异,为后期开发一套行之有效的针对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的标准化治疗策略提供理论依据。前两种表达系统为单纯AAV介导的基因治疗系统,可直接运用于非转基因生物,因此具有一定的临床参考价值;后两种是结合了AAV与转基因动物模型的重编程系统,主要利用细胞谱系追踪技术研究星形胶质细胞体内重编程的机制,因此具有一定的基础理论参考价值。方法:本研究通过立体定位注射将载体病毒AAV注射入小鼠背侧海马下托（dorsal subiculum,dSUB）,运用4种表达系统进行NeuroD1介导的星形胶质细胞-神经元（astrocyte-to-neuron,At N）重编程,利用免疫组织化学方法分析各系统NeuroD1过表达能力、重编程效率、星形胶质细胞靶向特异性、重编程神经元亚型等。利用电生理学方法验证NeuroD1重编程神经元的生理功能特性。结果:AAV-FLEx+Aldh1l1::Cre/ER2转基因小鼠系统的星形胶质细胞特异性最高,可以达到99.3%,但是其表达NeuroD1的能力较低,未能完成At N重编程,且诱发了星形胶质细胞异常高表达少突胶质细胞转录因子2（Oligodendrocyte Transcription Factor 2,Olig2）。AAVFLEx+AAV-GFAP::Cre系统和AAV-FLEx+GFAP::Cre转基因小鼠系统具有较强的NeuroD1过表达能力,重编程后主要得到谷氨酸能神经元;AAV-GFAP::NeuroD1系统中NeuroD1表达量较低,且该系统重编程后主要得到GABA能神经元。AAV-GFAP::NeuroD1系统、AAVFLEx+AAV-GFAP::Cre系统和AAV-FLEx+GFAP::Cre小鼠系统的重编程效率分别约为43.9%、70.0%和92.0%。除AAV-FLEx+AAV-GFAP::Cre系统（64.4%）外,其余系统均有很高的星形胶质细胞特异性（均在90%以上）。结论:不同重编程系统各有特点,需根据基础研究和临床应用的场景选择合适的方案。另外,AAV-FLEx+Aldh1l1::Cre/ER2转基因小鼠系统中,Olig2在星形胶质细胞中的异常高表达可能阻碍了At N重编程过程。但目前其机制不明,有待进一步的深入研究。第二部分利用NeuroD1体内重编程技术治疗阿尔茨海默病小鼠背景:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是以认知损伤为主要表现的神经退行性疾病,其发病隐秘,进程缓慢,机制尚未完全明确,目前尚无有效的治疗药物。近几年的新药临床试验几乎都宣告失败。目前我国约有1000万AD患者。随着我国人口老龄化的加速,这一数字在未来10年内可能激增至2000万,将给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。研究表明AD的进行性认知衰退与其神经元和突触的逐渐丢失密切相关。AD动物模型和AD患者大脑的尸检结果也显示与学习记忆密切相关的大脑皮层和海马等脑区存在严重的神经元和突触丢失现象,提示基于体内重编程的原位神经再生技术在AD治疗方面具有很大的临床应用潜力。目的:第一部分结果已证明AAV-FLEx+AAV-GFAP::Cre系统下NeuroD1介导的At N重编程可在小鼠dSUB区原位产生兴奋性谷氨酸能神经元,与既往报道的5xFAD小鼠海马中丢失的神经元亚型相一致,因此本研究着重探索AAV-FLEx+AAV-GFAP::Cre系统下NeuroD1介导的At N重编程能否弥补5xFAD小鼠模型dSUB区中丢失的神经元、增加突触联系及改善AD模型小鼠的空间记忆功能。方法:在5xFAD小鼠dSUB区域内立体定位注射AAV-FLEx+AAV-GFAP::Cre病毒载体系统,进行NeuroD1介导的At N重编程,再利用免疫组织化学方法分析dSUB体积、神经元数量、突触等变化情况,利用Morris水迷宫实验评价空间记忆能力。结果:免疫荧光成像显示,经过NeuroD1重编程治疗,AD小鼠dSUB神经元数量显著增加,体积萎缩情况得到显著改善,并且dSUB内的树突和谷氨酸能突触均显著增多。但在Morris水迷宫中,对照组和NeuroD1组中小鼠在目标象限中停留时间的差异无显著性,提示空间记忆功能的改善有限。结论:NeuroD1介导的dSUB区中At N重编程缓解了局部病理性损伤,但是对空间学习记忆能力的改善有限。说明该技术在AD模型小鼠大脑内的局部区域具有一定的修复作用,但达到临床认知功能改善可能需要更大范围的原位神经再生。第三部分Olig2在成年小鼠CNS内分布特征研究背景:Olig2和NeuroD1同属b HLH转录因子家族,在神经系统发育过程中发挥不同作用。NeuroD1主要促进神经发生,而Olig2主要影响脊髓运动神经元和少突胶质细胞的定向分化。在成年小鼠大脑中Olig2主要促进少突胶质细胞相关基因的表达,而抑制内在的自发神经再生。研究还表明Olig2基因的启动子和增强子区域是NeuroD1结合的最强靶区之一。因此两者可能存在潜在的相互作用。在本课题的第一部分研究中,我们发现较低剂量地过表达NeuroD1未能在28天的观察期内实现体内原位星形胶质细胞重编程。同时,我们观察到星形胶质细胞异常高表达Olig2。结合相关领域内已发表的研究,我们推测星形胶质细胞内Olig2的高表达可能会抑制NeuroD1介导的At N重编程。另外在本课题的第二部分研究结果中,我们发现在AD模型小鼠dSUB区域内的体内重编程可以显著改善该区域的脑萎缩和突触联系,但对空间学习记忆能力的改善并不显著。考虑AD病理改变累及dSUB外的众多脑区,因此更大范围乃至全脑的原位神经再生对AD模型小鼠治疗可能更有价值。进一步考虑到Olig2可能会阻碍NeuroD1介导的At N重编程,在开展大范围星形胶质细胞的体内原位重编程研究之前,我们还需要了解不同脑区星形胶质细胞中Olig2的基线表达情况,为后续开展不同脑区的原位神经再生提供前期数据。目的:利用免疫组织化学和激光共聚焦显微成像技术,系统性地研究Olig2在成年期小鼠中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）内的表达分布特征,并进一步的分析不同脑区星形胶质细胞中Olig2的基线表达情况。方法:对正常成年小鼠CNS（包括大脑和脊髓内的13个区域）进行免疫荧光染色和激光共聚焦显微成像,分别分析其中Olig2和少突胶质细胞前体细胞（oligodendrocyte progenitor cells,OPCs）、少突胶质细胞、神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的特异性标志物的共定位情况。利用免疫荧光强度比较Olig2在不同类型细胞内的表达水平。结果:Olig2广泛分布于成年期CNS的OPCs和少突胶质细胞内,但不表达于神经元和小胶质细胞。Olig2高表达于特定CNS区域（嗅球、中脑、丘脑、延髓和脊髓）内的星形胶质细胞内,并且Olig2在这些星形胶质细胞中的表达水平接近于其在少突胶质细胞中的表达水平;而皮层、海马和纹状体内的星形胶质细胞则很少表达Olig2。结论:正常成年小鼠CNS内的某些特定区域存在着大量的Olig2+星形胶质细胞,然而Olig2对正常星形胶质细胞的生理功能具有哪些影响、Olig2+是否会阻碍NeuroD1介导的体内胶质细胞重编程以及其对重编程后神经元的亚型分类的影响还有待进一步的研究。这些前期的数据对于我们以后开展不同脑区的体内星形胶质细胞重编程具有重要的指导意义。