目的生物人工胰腺利用微囊化细胞技术,使用具有半透性的生物材料封装胰岛细胞构建而成,可以在不需要使用免疫抑制剂的情况下,完全模拟胰岛素分泌的生理模式,控制血糖平稳,已成为一种极具潜力的治疗1型糖尿病的方法。尽管微囊化胰岛移植已取得巨大进步,但细胞的长期存活和胰岛素分泌功能的维持却不能普遍实现。其主要原因是氧气及营养物质缺乏和宿主对移植胰岛细胞的免疫反应,后者通常表现为囊周纤维增生。本研究基于微囊化胰岛存活周期短这一难题,针对改善细胞缺氧和囊周纤维增生两个主要方面,设计合成纳米粒-海藻酸钡吸附聚赖氨酸接枝聚乙二醇(NPs-ABPP)微囊用于封装胰岛细胞,可以同时增加细胞氧供并减轻囊周纤维增生,从而延长胰岛细胞生存时间并维持胰岛素分泌功能。方法与结果针对细胞缺氧问题,选用具有较高溶氧能力的全氟己烷(PFH)为原料,而由于PFH难溶于水,我们利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)通过自组装技术合成了以PFH为核,PLGA为壳的PFH/PLGA@NPs。通过粒径及形态结构表征发现,该纳米粒为壳-核球形结构,粒径为纳米级、分布均匀,且可以溶于水并稳定存在。溶氧能力测定结果可见,通入相同的氧流量,纳米粒溶液氧浓度比水溶液氧浓度更高且增加更快,说明纳米粒具有较高的溶氧能力。CCK-8实验结果可见,MIN 6细胞与不同浓度纳米粒共培养后细胞存活率均大于80%,说明纳米粒的细胞毒性低,生物相容性较好。为选择更适宜的细胞载体,分别用浓度1%、1.5%、2%和3%海藻酸盐(Alg)滴入氯化钡溶液制备海藻酸钡(AB)微囊。形态学观察可见,1%AB微囊形状不规则,后三者均可形成规则球形结构。稳定性测试发现,将微囊置于摇床摇动14天后,1%和1.5%AB微囊未破损率均<10%,而2%和3%AB微囊未破损率均>95%;再将AB微囊与螯合剂混合后,随Alg溶液浓度增加,AB微囊直径变化越小,说明微囊稳定性随Alg浓度增加而提高。将MIN 6细胞分别封装于4种微囊内培养10天后进行吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色观察发现,AO染色细胞均较多,定量分析可得细胞存活率均>85%。从形态结构、稳定性、细胞存活率和材料消耗等角度分析,最终选择2%AB微囊进行后续实验。针对囊周纤维增生(PFO)问题,我们合成了聚赖氨酸接枝聚乙二醇共聚物(PLL-g-PEG),然后利用静电吸附与AB微囊反应形成ABPP微囊。通过抗粘附测定可见,ABPP微囊比AB微囊吸附的纤维蛋白原更少;将微囊分别与RAW264.7细胞和NIH 3T3细胞共培养后,DAPI染色可见,ABPP微囊表面细胞粘附较少,具有较强的抗粘附性。通过免疫原性测定发现,与AB微囊相比,ABPP微囊与RAW 264.7细胞共培养后,CD 86染色细胞明显较少,表明M1巨噬细胞极化较少,且巨噬细胞分泌的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β均显著降低,说明ABPP微囊的免疫原性低,不易诱发炎症反应。将PFH/PLGA@NPs与Alg溶液混合后滴入氯化钡溶液反应,制备NPs-ABPP微囊。通过溶氧能力测定可见,NPs-ABPP微囊中氧浓度较高且升高较快,说明纳米粒封装于微囊仍具有较高的溶氧能力。将MIN 6细胞封装于微囊中置于缺氧环境下培养,通过AO/PI染色观察可见,NPs-ABPP微囊组AO染色细胞多于ABPP微囊组,定量分析可得NPs-ABPP微囊组细胞存活率显著升高,说明PFH/PLGA@NPs可以改善细胞缺氧,提高细胞存活率。GSIS实验结果表明,缺氧条件培养3天,高糖环境刺激MIN 6细胞分泌胰岛素,NPs-ABPP微囊组胰岛素浓度明显高于ABPP微囊组,证明缺氧环境下PFH/PLGA@NPs可以维持胰岛细胞分泌胰岛素功能。结论本研究制备了兼具改善缺氧和微囊PFO形成的NPs-ABPP新型生物微囊。在缺氧条件下,PFH/PLGA@NPs可以增加局部微环境氧含量,减少细胞损伤,提高胰岛细胞存活。PLL-g-PEG吸附于AB微囊表面形成的刷状结构,可以形成水化膜,从而降低蛋白和细胞粘附,减少M1型巨噬细胞的极化及炎性因子的分泌,最终减少PFO形成,保障微囊孔道通畅及必要的物质交换。两者相互影响,协同作用,共同维持细胞生存的微环境稳态,实现微囊化胰岛细胞的长期生存和胰岛素的长期分泌。该研究为生物人工胰腺治疗1型糖尿病临床应用的探索提供了理论基础和研究价值。