目的弓形虫病是一种严重危害人类健康和影响优生优育的人畜共患疾病。ELISA法是目前诊断弓形虫感染的常规检测方法,主要是通过检测特异性IgG(免疫力水平指标)和IgM(近期感染指标)抗体的有无来判断机体的感染情况,但该方法存在不能同步检测IgG和IgM抗体,检测时间长,耗费试剂多,操作繁琐等缺点。量子点是一种新型荧光标记材料,与传统荧光染料相比具有以下优点:激发波长范围较宽,同一波长的光能激发不同大小的量子点;发射波长窄而对称,同时使用具有不同光谱特征的量子点时,发射光谱间重叠较少;不同粒径和组成的量子点其发射波长不同。因此,应用不同发射波长的量子点对不同的待检分析物同时进行标记,可以达到多个指标同时检测的目的。本研究将量子点标记技术与免疫磁珠技术相结合,研制了一种可同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体的检测体系,本方法不仅操作简便快速,还具有较高的特异性和敏感性,可用于弓形虫感染的筛查。方法:1.抗原固化磁性微球采用碳二亚胺交联法将弓形虫重组抗原固化在羧基磁性微球表面。通过EDC和NHS溶液活化磁珠表面羧基后,活化的羧基再与抗原上的氨基进行反应,从而将弓形虫抗原固化在磁性微球表面,获得免疫磁珠。通过对磁性微球的粒径、EDC/NHS活化剂浓度等固化条件进行选择优化,建立稳定、高效的免疫磁性微球固化方法。2.量子点标记二抗采用碳二亚胺交联法将羧基化CdS/ZnS量子点与抗体进行标记.分别以发射波长为580nm、618nm的量子点分别标记羊抗人IgG和羊抗人IgM抗体,研究pH值,二抗加入浓度,反应时间对量子点发光的影响,制备适用于抗弓形虫IgG和IgM抗体同步检测体系的量子点标记二抗试剂。3.分别建立抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法以固化了弓形虫抗原的磁性微球作为固相载体,量子点标记二抗作为检测抗体,采用间接法原理,分别建立抗弓形虫IgG和IgM抗体的检测方法,并对检测条件进行优化。分别检测人抗弓形虫IgG、IgM标准品,观察本方法的线性范围、灵敏度、重复性和准确度。收集临床标本,分别用本方法与进口ELISA试剂盒进行检测并对结果进行比较,观察两种检测方法的结果有无统计学差异。4.抗弓形虫IgG和IgM抗体同步检测体系的构建在已建立的单个抗体检测方法的基础上,对关键检测条件进行统一和优化,构建抗弓形虫IgG和IgM抗体同步检测体系。同步检测人抗弓形虫IgG、IgM标准品,观察该体系的线性范围、灵敏度、重复性和准确度。用已构建的同步检测体系对280例临床标本进行同步检测,并将结果与进口ELISA试剂盒进行比较,探讨多指标同步检测的可行性。主要结果一、方法学建立(1)抗原固化磁性微球选择粒径为3μm的羧基磁性微球作为固相载体,加入EDC(6mg/ml)和NHS(4mg/ml)溶液进行活化,弓形虫抗原的最适固化浓度为50μg/mL,固化效率为54.2%。(2)量子点标记二抗实验结果表明,量子点标记二抗的最适反应pH值为6.0,羊抗人IgG、IgM抗体的最适标记浓度分别为40μg/mL、50μg/mL。(3)抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法的建立分别建立了抗弓形虫IgG和IgM抗体检测方法,经过实验优化,量子点羊抗人IgG、IgM的最适工作浓度分别为1:50、1:100,待测血清最适稀释度均为1:100。通过检测200例健康人血清样本确定了抗弓形虫IgG抗体和IgM抗体Cutoff值分别为: 0.45、0.44。(4)同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体检测体系的建立同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体,量子点标记羊抗人IgG、IgM的最适工作浓度分别为1:200、1:100,待测血清最适稀释度为1:100。检测200例健康人血清样本确定了抗弓形虫IgG抗体和IgM抗体Cutoff值分别为:0.55、0.51。同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体两个指标,仅需30min就可完成整个检测过程,而常规ELISA方法一次只能检测单个指标,完成两个指标的检测往往需要4h。二、方法学评价(1)抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法的方法学评价按已建立的方法分别检测人抗弓形虫IgG、IgM标准品,其最低检测限分别为:3.04IU/ml、3.11 IU/ml。批内重复性实验平均CV分别5.2%、5.4%,天间重复性实验平均CV分别为6.5%,6.6%。准确性实验偏倚系数分别为:6.0%,6.3%。20例其它TORCH系列阳性血清标本与本方法均无交叉反应。阻断实验结果显示,弓形虫IgG和IgM抗体的阻断率均在50%以上。(2)同步检测抗弓形虫IgG、IgM抗体检测体系的方法学评价同步检测人抗弓形虫IgG和IgM标准品,其最低检测限分别为:4.21IU/ml、4.32IU/ml;批内重复性实验平均CV分别为: 6.0%、6.2%;天间重复性实验平均CV为7.2%、7.4%;准确性实验偏倚系数分别为:7.6%,7.2%。三、方法学比较(1)抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法的方法学评价收集临床标本,用已建立的抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法分别进行检测,并与进口ELISA试剂盒检测结果比较。抗弓形虫IgG和IgM抗体检测结果的符合率分别为: 96.5%、96.8%,采用SPSS10.0软件对数据进行配对χ2检验分析, P值均>0.05,认为两种方法分别检测抗弓形虫IgG和IgM抗体的测定结果无显著性差异。(2)同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体检测体系的方法学评价收集临床标本,用已构建的抗弓形虫IgG、IgM抗体同步检测体系进行同步检测,并与进口ELISA试剂盒检测结果比较。弓形虫IgG和IgM抗体检测结果的符合率分别为: 96.4%,97.1%,采用SPSS10.0软件对数据进行配对χ2检验分析, P值均>0.05,认为本方法同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体的测定结果与ELISA法无显著性差异。结论1.以磁性微球作为固相载体,在其表面成功固化了弓形虫重组抗原,固化效率最高可达54.2%。利用磁珠可快速富集的特性,在加快了检测速度同时,也极大的提高了检测灵敏度。本法同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体仅需30 min,较ELISA法的2.5h明显加快。2.建立的抗弓形虫IgG、IgM抗体单指标检测方法,其灵敏度、检测范围、重复性、稳定性等达到临床初步应用的要求,为同步检测体系的建立奠定了基础。3.选用不同发射波长的量子点分别标记不同二抗,经同一激发光激发,发射两种不同波长的光,实现了多指标的同步检测,为基于量子点标记同步检测更多抗体提供了技术支持。4.构建的抗弓形虫IgG和IgM抗体同步检测体系,具有特异性较好、速度快、操作简便、灵敏度高等优点,为简化操作步骤、缩短报告时间创造了条件,也为进一步研制TORCH感染多种病原体的同步检测提供了一种新的技术手段。