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ALG-2是一种22kD的胞内Ca<2+>结合蛋白,属于pEF手型蛋白家族并拥有螺旋-环-螺旋式的Ca<2+>结合结构域。它是由P.Vito等在1996年通过“Death trap”分化呈示法所发现的与凋亡相关的蛋白。在鼠组织中,ALG-2是一个广泛表达的蛋白,其表达量最高的器官为胸腺和肝脏。实验表明,在由TCR、Fas和糖皮质激素所诱导的T细胞凋亡过程中,ALG-2起了关键性作用,因为ALG-2的损耗可阻碍该凋亡过程,但当它过表达时则可显著加强这些诱导因素的作用。我们在对家蚕蛹cDNA文库测序中,发现一个新的编码家蚕ALG-2蛋白基因的cDNA序列,以此序列为信息探针检索家蚕EST数据库,获得一个凋亡相关基因-2的cDNA全序列。该基因全长为697bp,由534 bp的开放阅读框序列(ORF)、117bp的5端非翻译区序列(5UTR)和46 bp的3端非编码区序列(3UTR)组成。由ORF编码的177个氨基酸序列与其他真核生物间具有较高的同源性。根据该序列,预测其分子量为20.61 kD,等电点为4.97。
RT-PCR扩增alg-2基因完整的ORF,并将其克隆到融合表达载体pET-28a相应的酶切位点上,成功得到融合蛋白表达质粒pET-28a-BmALG-2。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后裂解菌体进行SDS-PAGE分析,在24 kD处有一条明显的蛋白条带,与预期大小相符。约半数融合蛋白以可溶性的形式存在,超声波裂解菌体后,采用亲和层析纯化融合蛋白His6-BmALG-2。以该融合蛋白为抗原免疫两只雄性新西兰兔制备了该重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗体血清的效价可达到1:12000以上。Western印迹实验呈阳性并发现在Bm5细胞中也有特异性条带,进一步证实了多抗的特异性。亚细胞定位结果表明,ALG-2在家蚕细胞Bm5中分布于细胞质和细胞核。为了研究BmALG-2在家蚕细胞中的功能,我们合成了dsRNA并进行RNAi实验。我们发现,当Bm5细胞经72h干扰后,其细胞形态变化并不明显,但通过MTT法检测后发现,其细胞活性有所降低。而流式细胞仪检测的结果则说明,干扰后的Bm5细胞被阻滞于G1期。