【摘 要】
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生长素响应因子（Auxin response factor）是可以调控生长素响应基因表达的转录因子,在植物生长发育、调控逆境方面有重要作用;WRKY转录因子是在植物中非常大的转录因子家族之一,研究发现WRKY蛋白可以在种子萌发、衰老,调控生物胁迫和非生物胁迫方面有重要作用。本实验室前期得到了生长素响应因子TaARF9、WRKY转录因子TaWRKY4两个基因的碱基序列,本试验的研究主要内容是从中国春
【基金项目】
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国家转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08002002-010、2018ZX0800909B-002）； 陕西省重点研发计划项目（2018NY-026、2022NY-186）； 杨凌种业创新中心重点研发项目（Ylzy-xm-03）；
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生长素响应因子（Auxin response factor）是可以调控生长素响应基因表达的转录因子,在植物生长发育、调控逆境方面有重要作用;WRKY转录因子是在植物中非常大的转录因子家族之一,研究发现WRKY蛋白可以在种子萌发、衰老,调控生物胁迫和非生物胁迫方面有重要作用。本实验室前期得到了生长素响应因子TaARF9、WRKY转录因子TaWRKY4两个基因的碱基序列,本试验的研究主要内容是从中国春小麦中克隆这两个基因,在干旱胁迫、盐胁迫及激素处理下对中国春小麦中TaARF9、TaWRKY4的表达特性及在不同组织部位的表达量进行分析,利用T3代转基因过表达株系和相应的拟南芥突变体、野生型为材料,对干旱和盐胁迫及ABA等激素处理下的转基因拟南芥的抗逆性及抗逆相关生理生化指标进行了鉴定,主要研究结果如下:1、TaARF9的转录本长度为2863bp,CDS长度1917bp,编码638个氨基酸,蛋白分子量为70.80k Da,等电点为5.69。在干旱胁迫、盐胁迫以及ABA、GA、6-BA激素处理下对中国春小麦中TaARF9的表达特性进行分析,发现TaARF9表达量明显上调。组织特异性表达分析结果显示TaARF9基因在叶、根中表达量非常高,在茎中的表达量最低。2、将TaARF9基因转化拟南芥,对T3代TaARF9转基因株系进行阳性鉴定,并提取阳性植株的RNA进行定量分析,筛选到了过表达株系OE-5,OE-9,OE-10。对购买的突变体拟南芥进行纯合性鉴定,筛选出纯合株系用于后续试验。3、以野生型拟南芥、T3代TaARF9转基因株系以及突变体拟南芥为试验材料,在甘露醇、Na Cl、ABA、GA、6-BA条件下进行了种子萌发率的统计,结果表明转TaARF9过表达株系拟南芥种子的萌发率显著高于野生型拟南芥种子的萌发率,突变体株系拟南芥种子的萌发率最低。对甘露醇、ABA处理下的根长扫描结果显示,转TaARF9过表达株系的总根长显著高于WT,WT的总根长略高于突变体纯合株系的根长。对在自然干旱、盐处理下试验材料的存活率进行统计,结果显示转TaARF9过表达株系的存活率明显高于野生型株系,野生型株系的存活率略高于突变体株系的存活率。对自然干旱下、盐处理下试验材料的生理生化指标测定结果显示,转TaARF9过表达株系的叶绿素含量、脯氨酸含量都显著高于WT,丙二醛含量低于WT,WT的叶绿素含量、脯氨酸含量都高于突变体,丙二醛含量低于突变体。对离体条件下的莲座叶失水率的测定结果表明TaARF9过表达株系的失水率高于WT,WT的失水率高于突变体的失水率。以上结果说明过表达TaARF9基因能提高拟南芥植株的抗旱性和耐盐性。4、TaWRKY4基因的转录本长度为2105bp,CDS长度1548bp,编码515个氨基酸,蛋白分子量为54.62k Da,等电点为7.32。在干旱胁迫、盐胁迫以及ABA、GA、6-BA激素处理下对TaWRKY4的表达特性进行分析,发现TaWRKY基因表达量均上调。组织特异性表达分析表明,在根中TaWRKY4基因表达量最高,其次是在叶中,在茎中表达量最低。5、将TaWRKY4基因转化拟南芥,对T3代TaWRKY4转基因株系进行阳性鉴定,并提取阳性植株的RNA进行定量分析,筛选到了过表达株系OE-4,OE-5,OE-10。对购买的突变体拟南芥进行纯合性鉴定,筛选出纯合株系用于后续试验。6、以野生型拟南芥、T3代TaWRKY4转基因拟南芥以及突变体拟南芥为试验材料,在甘露醇、Na Cl、ABA条件下进行了种子萌发率的统计,结果表明转TaWRKY4过表达株系拟南芥种子的萌发率显著高于野生型拟南芥种子的萌发率,野生型拟南芥种子的萌发率高于突变体株系种子的萌发率。对甘露醇、ABA处理下的根长扫描结果显示,转TaWRKY4过表达株系的总根长显著高于WT,WT的总根长略高于突变体纯合株系。对在自然干旱、盐处理下试验材料的存活率进行统计,结果显示转TaWRKY4过表达株系的存活率明显高于野生型株系,野生型株系的存活率略高于突变体株系的存活率。对自然干旱、盐处理下的试验材料进行生理生化指标的测定结果显示转TaWRKY4过表达株系的存活率、叶绿素含量、脯氨酸含量显著高于WT,丙二醛含量显著低于WT,WT的存活率、叶绿素含量、脯氨酸含量高于突变体,丙二醛含量低于突变体。对离体条件下的莲座叶失水率进行测定,结果显示TaWRKY4过表达株系的失水率高于WT,WT的失水率高于突变体的失水率,以上结果说明转TaWRKY4拟南芥抗旱性、耐盐性提高。这些研究结果为后续利用这两基因进行小麦抗逆性遗传改良提供了理论依据。
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