研究背景骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是以多关节破坏为主要特征的慢性退行性变疾病,是中、老年人的常见病和多发病,主要特点是关节软骨的破坏、细胞外基质的减少、软骨下骨的改变和滑膜的炎性改变等。在世界范围内,流行病调查显示60岁以上的人群中超过10%患有骨性关节炎,是容易被低估的健康问题。在X光检查下可有骨赘的形成和软骨下骨的硬化等特征性表现。骨性关节炎病因不明,与多种因素相关,患者在临床上的表现不同,症状轻微者仅表现为膝关节的疼痛,起初为阵发性,后为持续性,活动时疼痛加重,上下楼梯时尤其明显。近年来,很多骨科相关专家在OA的发病原因进行了大量的研究,但对其发病机制尚未有确切的定论。长期以来,OA被认为是关节的压力增高(特别是承重关节遭受大负荷压力和关节解剖的不协调)和软骨基质减弱的结果。1990年以后随着分子生物学的发展,这种观念被慢慢改变。更多的炎性因子及前列腺素被发现可以促使软骨细胞产生基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs),从而形成了OA的“炎症理论”。所以,OA是涉及到软骨,骨及滑膜释放炎症介质的极其复杂的疾病,最终的病理过程是细胞基质合成与降解的平衡受破坏引起的关节组织破坏。另外,在OA病变中发现有软骨细胞凋亡的特征性改变,如染色质凝聚、核碎片、细胞皱缩、凋亡小体等。因此,软骨细胞凋亡已被认为是关节软骨退行性改变的病理因素之一, 是OA发病机制中的重要环节。白细胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)作为一种致炎细胞因子,在骨性关节炎病理生理过程中是一个重要因素,在整个致炎以及软骨细胞凋亡过程中处于关键地位,是OA病因之一。IL-1β是由软骨细胞的单核细胞,成骨细胞和滑膜组织产生的,可以促进分泌一系列的炎症因子及分解代谢介质,可以单独或者和其他细胞因子配合激活炎症。在OA的病人中,滑膜液,滑膜,软骨下骨和软骨中IL-1β水平都有所提高。在兔的膝关节中单独的注射IL-18会比注射其他细胞因子导致更严重的破坏。细胞的生物活化是由IL-1β介导的,通过特殊的细胞表面受体白介素-1I型受体(IL-1RI)结合实现的,与正常的细胞相比,这种受体在OA的软骨细胞和滑膜纤维细胞中增多。正常的软骨细胞中软骨表面的个别细胞中存在IL-1,而受创伤,自由基等刺激激活的软骨细胞膜上IL-1β受体表达升高。这种高表达的IL-1β与软骨细胞膜上的受体结合,通过信息传递系统将病变的信息传递到细胞内,从而干扰软骨细胞的正常代谢活动。同时,这种不平衡的代谢活动可以改变正常软骨细胞正常结构和功能,继而促进软骨产生炎症,进一步导致细胞凋亡。最终软骨细胞基质降解和滑膜炎等组织病变发生,影响骨及软骨代谢。同时,IL-1β被证实是一种从OA软骨细胞原位释放的很关键的细胞因子,可以提高基质降解酶的水平,抑制蛋白多糖的合成,最终导致软骨的丢失。IL-1β对软骨细胞分解代谢的影响主要是通过诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)的表达和活化,导致软骨基质降解来实现的,可通过上调基因mRNA的表达,尤其是增加了MMP3,MMP9,MMP13等的合成,打破了基质金属蛋白酶-组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)的平衡,从而促进基质大分子降解。MMPs可以特异性裂解胶原分子,导致胶原网受到破坏,使关节软骨抗应力能力降低,使软骨细胞发生凋亡和细胞外基质降解,最终软骨被破坏。此外,IL-1β对于炎症反应过程很重要,促使关节组织破坏进而释放一些炎症介质如：环氧酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase, iNOS)。COX-2是以一种限速酶,可以激发产生前列腺E2((prostaglandin E2, PGE2),一种重要的炎症及分解代谢过程中的炎症介质。iNOS在OA的关节液中存在可以催化氧化生产大量的一氧化氮(NO)致使软骨破坏。一氧化氮还可以激活产生基质金属蛋白酶MMPs(一种抑制合成胶原和蛋白多糖的分解酶),抑制产生IL-1Ra,加速软骨细胞凋亡。IL-1β还可以刺激产生活性氧(reactive oxygen species, ROS),导致软骨降解,最终导致软骨细胞凋亡,加速OA的发病进程。大量实验证实,IL-1β可以刺激体外培养的关节软骨释放ROS,经过caspase-3途径诱导细胞凋亡发生。同时,实验研究表明,IL-1β可引起线粒体形态、功能变化及线粒体退化,引起膜电位下降,线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以及ATP合成减少。Bcl-2家族控制着线粒体外膜和内膜的通透性,其中包括Bax,Bad,Bid等。Bcl-2主要分布于线粒体膜和细胞质中,具有拮抗软骨细凋亡的作用；而Bax和Bid等分布于细胞质中,具有促进软骨细胞凋亡的作用。Bid位于细胞胞浆中,可以被caspase-8切割成截断的Bid(truncated Bid,tBid),tBid有很强的促凋亡活性,转移到线粒体膜并将凋亡信号传递至线粒体,造成线粒体损伤并诱导其激发线粒体通透性转变,释放有细胞色素C(Cytochromec,Cytc),引发细胞凋亡。目前关于OA的治疗包括非药物治疗、药物治疗和手术治疗,其中,药物治疗是治疗骨性关节炎中最主要治疗和基础的治疗。药物可以可大致分为非特异性药物和特异性药物两种,均能有效地缓解患者的疼痛、肿胀和关节活动障碍等症状。药物的药理作用是发挥治疗作用的关键,其主要机理是阻断或抑制OA的某一发病机制,而达到治疗或改善缓解OA的作用。目前临床上推荐的治疗膝关节骨性关节炎的一线传统治疗药物是非甾体抗炎药(Non steroidal Anti-inflammatory Drugs, NSAIDs)和对乙酰氨基酚。但是一线药物长期使用会引起肾脏和消化系统的损害,一些研究还显示对软骨有破坏的副作用,这些不良反应在临床中是无法忽视的,往往限制了临床使用。传统的非甾体类抗炎药对COX-1和COX-2的抑制作用缺乏选择性,因此在发挥治疗作用的同时会产生许多毒副作用。近年来人们认识到,非甾体类抗炎药的抗炎作用是通过抑制COX-2来实现的,而不良反应的产生则是由于药物同时抑制了COX-1的活性。有报道显示非甾体类抗炎药引起的消化性溃疡的发病率为15%-20%,在常规用药剂量下,不同的非甾体类抗炎药对胃肠道并发症发生的危险性也有不同。这些副作用中,药物性肾损害的后果很严重。其中可引起急性肾功能不全、肾炎、肾乳头坏死、高血钾等一些严重的并发症。肝损害可以使转氨酶升高严重者可导致肝细胞坏死。以上这些毒副作用几乎可以涉及到所有的传统非甾体类抗炎药,其发病率远高于未服药的人。其它不良反应主要还有血小板降低、再生障碍性贫血等血液疾病和药物性变态反应疾病。需长期服用的患者者,往往难以避免其胃肠道和肝、肾等方面的毒副反应。由于OA的西药治疗过程中往往会带来一定的副作用,使越来越多的研究者转向中草药的单一成分治疗OA的研究,以期寻找一种对OA治疗有效的中草药提取的单一成分。杜仲苷是一种天然的化合物可以在多种植物的叶子中提取,比如桃叶珊瑚,杜仲等,被证实有一系列的药物作用,值得注意的是其较强的抗炎的作用。有研究证实杜仲苷成分可以有效消除炎症引起的水肿,具有较强的抗炎作用。最近的文献还证实了杜仲苷的抗炎的特质是通过抑制NF-κB通路激活来实现的。此外,有实验证实了杜仲水提物,一种天然的中药其中含有杜仲苷成分,在骨性关节炎模型小鼠中,可以抑制炎症因子的产生继而阻止软骨基质降解。为进一步研究OA临床治疗方法,寻找一种副作用较小而有效的治疗骨性关节炎的药物,以期在临床上可以联合辅助用于OA的临床治疗,本研究通过构建IL-1p诱导的软骨细胞炎症模型,利用杜仲苷对IL-1β诱导的软骨细胞进行干预,从基因和分子水平研究杜仲苷对软骨细胞分解代谢及凋亡的影响情况,从而进一步研究其作用机制和传导通路。为中药单体化合物治疗OA提供实验证据,从而为下一步治疗骨性关节炎提供一种新的方法。研究方法1.大鼠软骨细胞的培养无菌条件下切除SD大鼠双侧后肢,用眼科剪和刀片削下膝关节软骨组织,用37℃的PBS缓冲液冲洗剪下来的软骨组织2～3次。将软骨组织移至离心管,加入1ml 0.25%胰蛋白酶,用眼科剪将滑膜组织剪成1mm4的块状组织。再加入2m1胰酶放入37℃孵箱30min,期间震荡1-2次。拿出离心2000rmp,5min,将上层液体倒掉,用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化2h,期间震荡4-5次,然后离心2000rmp,5min,去除上清,根据软骨组织块的大小及含量的多少加入适量的DMEM完全培养基(含10%胎牛血清和青、链霉素各10万/L双抗液体),晃动,搅匀。将含有完全培养基的组织块均匀地铺在培养瓶内,倒置培养瓶,再向培养瓶加入3～4ml完全培养基。拧紧瓶盖(透气培养瓶需拧紧,非透气培养瓶可稍留缝隙)放置于37℃、含有5%CO2培养箱内,24小时内将培养瓶缓慢翻转过来,使完全培养基完全浸没软骨组织块,继续放在培养箱中静置培养。每天在显微镜下每天观察软骨组织块生长情况。每2-3天换液一次,待组织块中软骨细胞长出完全后,传代培养,用第二代或者第三代软骨细胞进行后续试验。2.软骨细胞鉴定倒置相差显微镜观察：在软骨细胞分离、培养以及传代培养的各个时期通过倒置相差显微镜观察正常软骨细胞的形态、贴壁生长情况、生长特性及细胞密度,在软骨细胞的原代,一代,二代分别观察拍照。阿尔新蓝染色：用PBS溶液轻轻清洗细胞,去掉全培溶液。然后用4%多聚甲醛固定30min。加入1%的阿尔新蓝溶液,染色过夜,用DH20漂洗数次,直至无色,拿到显微镜下观察拍照。II型胶原免疫组织化学染色：取一到三代的软骨细胞滴在盖玻片上,使用爬片技术,待细胞基本生长成单层后,取出盖玻片,以4%多聚甲醛固定20min。3%过氧化氢室温下孵育10min,PBS缓冲液冲洗3次,每次5min,滴加正常非免疫动物血清室温下孵育10mmin。然后除去血清,滴加1：100兔抗-大鼠Ⅱ型胶原一抗,4℃过夜。PBS缓冲液冲洗3次,每次5min。滴加生物素标记的二抗,室温下孵育10min,PBS缓冲液冲洗3次,每次5min。DAB显色,苏木精复色,无水乙醇脱水,中性树胶封片。正置相差显微镜下观察并拍照记录。3.杜仲苷对软骨细胞增殖和毒性作用的测定：将软骨细胞接种于96孔板内,用1、10、20、50μM的杜仲苷以及完全培养基DMEM刺激24,48小时。用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测定细胞增殖和细胞毒性。4.杜仲苷对白细胞介素-1β诱导的软骨细胞炎症及分解代谢作用的影响将软骨细胞接种于6孔板中,用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培养基DMEM刺激30分钟,随后加入10 ng/ml白细胞介素-1β(IL-1β)24小时。用一氧化氮检测试剂盒(Griess Reagent)检测杜仲苷在不同浓度下对白细胞介素-1β的刺激下软骨细胞分泌一氧化氮(NO)的情况,用Real-Time PCR法及western blot法检测杜仲苷在不同浓度下对白细胞介素-1β的刺激下的软骨细胞内MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2的mRNA及蛋白表达水平的表达,进而探讨杜仲苷对白细胞介素-1β诱导的炎症及分解代谢的转导通路。5.白细胞介素-1β激活软骨细胞内NF-κB的时效反应将软骨细胞接种于6孔板中,用10 ng/ml白细胞介素-1β以及完全培养基DMEM分别刺激0、0.5、1、2、6小时。用Western blot检测IL-1β诱导下软骨细胞中,IKK、IκBα及胞核NF-κB亚基p65的磷酸化及表达情况,确定NF-κB通路被激活的最强时间点,进而探讨杜仲苷对IL-1β激活NF-κB通路的作用机制。6.杜仲苷对白细胞介素-1β诱导软骨细胞激活NF-κB的影响将软骨细胞接种于6孔板中,用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培养基DMEM刺激30分钟,随后加入10 ng/ml白细胞介素-1β(IL-1[)2小时。用Western blot检测不同浓度杜仲苷对IL-1β诱导下软骨细胞内IKK、IκBα及NF-κB亚基p65的磷酸化表达情况。用免疫荧光(Immunofluorescence microscopy)检测不同浓度杜仲苷对IL-1β诱导下软骨细胞内NF-κB亚基p65核转移的情况。7.杜仲苷对白细胞介素-1β诱导软骨细胞内活性氧族(ROS)提升的影响将软骨细胞接种于24孔板和共聚焦皿中,用不同浓度的(1、10、20、50μM)的杜仲苷,10ng/ml的IL-1β,及完全培养基DMEM刺激30分钟,在荧光酶标仪或共聚焦显微镜下用荧光探针二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测杜仲苷是否抑制IL-1p的刺激下软骨细胞产生的ROS。8.杜仲苷对白细胞介素-1β诱导的软骨细胞凋亡的影响将软骨细胞接种于6孔板中,用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培养基DMEM刺激30分钟,随后加入10ng/ml白细胞介素-1β(IL-1β)培养24小时。收集细胞,加入带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的AnnexinV及碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液,利用流式细胞仪来检测软骨细胞凋亡百分比。9.杜仲苷对白细胞介素-1p诱导的软骨细胞凋亡相关蛋白表达的影响将软骨细胞接种于6孔板中,用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培养基DMEM刺激30分钟,随后加入10ng/ml白细胞介素-1β(IL-1β)培养24小时。利用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表达情况。统计学分析：所有实验均重复3次,每个实验指标取这些数据的平均值,以均数±标准差表示,所有统计结果应用统计软件SPSS16.0完成。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA方法,在做两两比较时先计算方差齐性,方差齐性检验采用Levene’s Test,当方差齐时两两比较采用Dunnett法,设IL-1β组为对照组,方差不齐时两两比较采用Dunnetts T3法；多个样本非参数比较采取多个独立样本非参数检验(K Independent Samples Test),当P<0.05时为具有统计学意义。实验结果：1.杜仲苷在一定浓度范围内对软骨细胞无毒性作用：CCK8结果显示,杜仲苷在一定浓度范围(1、10、20、50μM)对软骨细胞没有显著的毒性作用。不同浓度杜仲苷对软骨细胞的活力影响,采用One-Way ANOVA进行统计分析,Levene’s Test方法检测软骨细胞中加入不同浓度杜仲苷得出OD值总体方差齐性(P=0.287)。基于方差齐性的方差分析结果表明各组间关节软骨细胞中OD值的差异不具有统计学意义(F24h=1.342,P24h=0.320; F48h=0.103, P48h=0.979,表1-1)。2.杜仲苷抑制白细胞介素-1β诱导的软骨细胞炎症及分解代谢RT-PCR结果显示在10ng/ml IL-1β刺激下软骨细胞内的MMP-3、MMP-9、 MMP-13、iNOS、COX-2的]mRNA水平显著提高,与加入培养基的对照组相比有统计学差异(P<0.05)。采用One-Way ANOVA进行统计分析,Levene’s Test方法检测总体方差齐性分别是(PMMP-3=0.263, PMMP-9=0.347, PMMP-13=0.414,PiNOS =0.074, Pcox-2=0.253)。基于方差齐性的方差分析结果表明,其余组与IL-1β组比较,软骨细胞中上述基因的表达有统计学差异(PMMP-3=28.045, P<0.05; FMMP-9=19.569, P<0.001;FMMP-13=9.679, P=0.002; FiNOS=16.181, P<0.001; F cox-2=39.690, P<0.001表1-2,1-3,1-4,1-5,1-6,1-7)。 Griess Reagent结果显示在10ng/ml IL-1β刺激下NO产生同样增多,其差异具有统计学意义(P<0.001)。对不同刺激组的软骨细胞NO产生水平,采用One-Way ANOVA进行统计分析,Levene’s Test方法检测总体方差齐性(P=0.439)。基于方差齐性的方差分析结果表明与IL-1β组比较,其余组NO产生水平有统计学差异(P=21.297,P<0.001,表1-7),随着浓度的增高抑制的程度随之增强。Western blot结果与RT-PCR的结果相似,在10ng/mlIL-1β刺激下软骨细胞内MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2的蛋白水平也显著提高,伴随着加入杜仲苷浓度的增加,软骨细胞内的MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2蛋白表达也逐渐被抑制,加入50μM杜仲苷的抑制作用最为明显。3.杜仲苷抑制白细胞介素-1β刺激的软骨细胞内NF-κB的激活在IL-1β的刺激作用下,随着时间变化(0、0.5、1、2、6h),NF-κB通路逐渐被激活而后恢复,软骨细胞内的NF-κB系统内的IκBα逐渐降解,IKK磷酸化,而NF-κB的亚基p65的磷酸化程度逐渐增高,在2小时达到高峰,6小时后下降,正常组无此效应。IL-1β诱导软骨细胞NF-κB系统激活的效应能够被杜仲苷(1、10、20、501μM)所抑制,随着加入的不同浓度(1、10、20、50μM),抑制作用逐渐增强,在50μM浓度下,作用最为明显。免疫荧光结果显示,在IL-1β的刺激作用下,荧光标记的NF-κB的亚基p65从细胞胞浆内转移至细胞核内,NF-κB通路被激活。被IL-1β刺激的软骨细胞,加入杜仲苷后荧光标记的p65多数存在于细胞浆内而非细胞核内,证明了IL-1β诱导软骨细胞NF-κB系统激活的效应能够被杜仲苷所抑制。4.杜仲苷降低白细胞介素-1β诱导软骨细胞内活性氧族(ROS)水平共聚焦显微镜下显示IL-1β能够显著提升软骨细胞内的荧光强度,与单纯培养基对照组比有显著的差异。而加入杜仲苷组软骨细胞内荧光强度明显减弱,提示杜仲苷能够显著降低IL-1β提升软骨细胞ROS的水平。采用One-Way ANOVA进行统计分析,Levene’s Test方法检测软骨细胞中加入不同浓度杜仲苷和IL-1β得出ROS水平总体方差齐性(P=0.885)。基于方差齐性的方差分析结果表明,与IL-1β组相比,加入50μM杜仲苷的软骨细胞中ROS水平具有统计学差异意义(F=6.003,P=-0.005,表2-2)。5.杜仲苷抑制白细胞介素-1β诱导的软骨细胞凋亡流式细胞检测结果显示IL-1β诱导软骨细胞凋亡,加入不同浓度的杜仲苷后,可见软骨细胞凋亡活性明显下降,并呈量效关系。采用One-Way ANOVA进行统计分析,Levene’s Test方法检测软骨细胞中加入不同浓度杜仲苷和IL-1β得出凋亡率总体方差齐性(P=0.082)。基于方差齐性的方差分析结果表明,与IL-1β组相比,加入不同浓度杜仲苷的软骨细胞凋亡率具有统计学差异意义(F=86.66,P<0.001,表2-1)。6.杜仲苷抑制白细胞介素-1β诱导的软骨细胞凋亡相关蛋白的表达在IL-1β刺激下促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表达水平增高,而同时加入杜仲苷与IL-1β组的软骨细胞内Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表达水平有所降低,对于凋亡保护蛋白Bcl-2,IL-1β刺激下并没有明显升高,反而下降,在同时加入杜仲苷与IL-1β组的软骨细胞内Bcl-2有所升高。结论：1.杜仲苷抑制白细胞介素-1β诱导的软骨细胞分泌的炎症介导因子iNOS、COX-2和基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-9、MMP-13产生。2.杜仲苷抑制白细胞介素-1β激活软骨细胞内NF-κB通路。3.杜仲苷降低白细胞介素-1β诱导软骨细胞内活性氧族(ROS)水平。4.杜仲苷抑制白细胞介素-1β诱导的软骨细胞凋亡及相关的蛋白表达。