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钙依赖蛋白激酶(Calcium-Dependent Protein Kinase/Calmodulin-like Domain ProteinKinase,CDPK)是植物和一些原生生物所特有的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶,可以不经钙调素的作用而直接被钙信号激活。分子量一般为40~90kDa。CDPKs是一个多基因家族,其中拟南芥有34个CDPKs,水稻中有31个。
Ca2+作为植物细胞中的第二信使,在调节植物从感应环境胁迫信号到下游基因的表达过程中有着关键作用,而CDPKs在植物钙信号转导中具有非常重要的作用,CDPK的活性受Ca2+、可逆磷酸化、磷脂、14-3-3蛋白的调节。CDPK有许多不同的底物,这决定了它功能的多样性。越来越多的证据表明CDPK参与了植物碳氮代谢、磷脂合成、离子和水分跨膜运输、细胞骨架调节、植物激素的信号转导和代谢、生长发育调节以及生物和非生物胁迫应答反应。研究表明,拟南芥的CDPKs能够在内质网膜、过氧化物酶体、细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体等部位分布。
拟南芥作为模式植物具有很多优点,但拟南芥是典型的甜土植物,其耐盐程度不高,而盐芥是一种与拟南芥近缘的十字花科植物,具有很多与拟南芥相同的优点:如形态类似、基因组小、生活史短、种子丰富和易于被转化等。但是,盐芥对多种胁迫的耐受能力远远高于拟南芥,它在短时间内能耐受高达500mMNaCl的冲击。
本实验从盐芥EST库中得到盐芥ThCDPK9基因,旨在研究盐芥ThCDPK9的生物学功能,该基因全长1614bp,所编码的蛋白序列有537个氨基酸(约60kDa)。iPSORT软件预测显示该蛋白既没有信号肽,也不是线粒体或叶绿体蛋白,又用PSORT软件进行分析,发现该蛋白定位于内质网。
首先构建了盐芥ThCDPK9-EGFP融合蛋白植物表达载体,并对洋葱表皮进行了农杆菌介导的转化,通过激光扫描共聚焦显微镜检测对盐芥ThCDPK9的亚细胞定位进行了初步的分析,但是没有检测到GFP信号。为了进一步研究该蛋白的定位,还浸染了拟南芥,已得到30株抗性苗。
构建了GST-ThCDPK9载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3),发现28℃,0.8mMIPTG诱导4h,GST-ThCDPK9融合蛋白主要以可溶性形式存在于上清中,该蛋白进一步纯化后可用于研究激酶活性的测定及互作蛋白、底物的鉴定等。
构建了盐芥ThCDPK9的基因沉默载体,导入农杆菌后,转化盐芥,用0.2%的除草剂筛选,获得25株转基因抗性苗。通过转基因盐芥中ThCDPK9的转录水平的检测及转基因盐芥的表型分析,来研究该基因的功能。对转基因盐芥植株进行了分子生物学检测发现:
1、各转基因株系中,以其基因组DNA为模板,均能通过PCR扩增出500bpBar基因特异性条带,表明T-DNA已经携带Bar基因及盐芥ThCDPK9基因片段整合进盐芥基因组中。
2、RT-PCR结果显示,已得到两株盐芥ThCDPK9基因表达下调的转基因株系。