前言在脑内,肾上腺素能和去甲肾上腺素能神经元位于脑桥和延髓,分别向上和向下投射神经纤维,其支配区域相当广泛,包括大脑皮质、边缘叶、海马和脊髓。正常状态下,对维持脑的功能发挥重要作用。在病理状态时,去甲肾上腺素除了与抑郁症有关外,目前研究发现在多发性硬化病人的脑白质中,星形胶质细胞出现β-肾上腺素受体的丢失;在老年性痴呆的病人,Gs蛋白耦联受体细胞内信号传导系统、cAMP和蛋白激酶A（PKA）功能降低。神经胶质细胞可分为星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。其中星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最为广泛的一类细胞。星形胶质细胞从胞体伸出许多长且有分支的线状伪足,并黏附在微血管周围。相邻星形胶质细胞间有缝隙连接,缝隙连接处狭窄,只允许小分子物质通过。星形胶质细胞是不可兴奋型细胞,具有支持、营养神经细胞,维持细胞外液离子平衡,构成血脑屏障及合成神经活性物质的功能,同时表达多种生物活性物质的受体,并且在免疫调节中起着重要作用。上皮生长因子受体（EGFR）的间接激活（Transactivation）是近年来发现的细胞内/外信号传导途径,是细胞根据外界刺激调节自身功能的一种巧妙方式。G蛋白耦联受体（GPCR）激活或外界刺激,导致某种生长因子的释放,进而激活自身和相邻的酪氨酸激酶受体,产生与直接激活酪氨酸激酶（RTK）相似效应的过程。EGFR被配体激活后启动细胞内信号传导,经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应等,调控细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡,并且与肿瘤的形成与恶化密切相关。β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素（Isoproterenol）对细胞的调节具有细胞特异性。在某些细胞异丙肾上腺素能够引起上皮生长因子受体的激活,而在另一些细胞则抑制细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化;即使同样是β-肾上腺素受体激活所引起的ERK磷酸化,其信号传导通路也不尽相同。本篇文章主要研究在星形胶质细胞,（1）β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素是否引起EGFR的间接激活;（2）异丙肾上腺素引起ERK磷酸化的信号传导途径。方法星形胶质细胞取材于新生CD-1小鼠大脑皮层。无菌操作,断头剥离脑膜后,取出脑组织。显微镜下分离出大脑皮层,切碎后加入培养液充分振荡1分钟。分别过100μm和70μm滤膜,放入Falcon Primaria培养皿中。用含有7.5 mM葡萄糖的DMEM培养基进行培养,每周更换两次新鲜培养液,培养三周后用于实验,实验前一周加入dBcAMP促进细胞分化成熟。首先在培养皿中加入PTX、H-89、GM6001、肝素、AG1478或PP1其中任一种抑制剂,37℃孵育15分钟。再加入异丙肾上腺素,孵育20分钟。移出培养液,应用PBS清洗细胞后,加入300μl/皿裂解液收集细胞。匀浆后的样品进行免疫凝胶电泳半定量测定ERK_1/2磷酸化水平。使用SPSS 12.0软件进行统计分析,多组资料用one-way ANOVA方法进行比较,P＜0.05表示差异具有统计学意义。结果1、异丙肾上腺素诱导ERK的磷酸化在星形胶质细胞,异丙肾上腺素引起ERK的磷酸化。异丙肾上腺素浓度为1nM时,p-ERK_1/2略有升高,而在10 nM、100 nM、1μM和10μM时,磷酸化水平显著升高,差异具有统计学意义。并且100 nM异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化作用时间较长,10、20和40分钟后均引起了p-ERK_1/2的显著增高,差异具有统计学意义。2、Gi蛋白抑制剂的作用0.2μg/ml Gi蛋白抑制剂百日咳毒素（PTX）不能抑制由异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化,差异具有统计学意义。表明β-肾上腺素受体激动剂引起的ERK磷酸化与Gi蛋白的βγ亚单位无关。3、PKA抑制剂的作用5μM PKA抑制剂H-89不能抑制由异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化,差异具有统计学意义。表明β-肾上腺素受体激动剂介导的ERK磷酸化与PKA无关。4、Epac诱导ERK的磷酸化在星形胶质细胞,10μM Epac1/2特异性激活剂8-pCPT-2’-O-Me-cAMP能够引起ERK的磷酸化,差异具有统计学意义。表明Epacs及其下游调节机制参与了β-肾上腺素受体激动剂介导的ERK磷酸化过程。5、金属蛋白酶抑制剂和肝素的作用10μM Zn²⁺依赖性金属蛋白酶抑制剂GM6001和1 mg/ml肝素均不能抑制由异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化,差异具有统计学意义。表明β-肾上腺素受体激动剂引起的ERK磷酸化与金属蛋白酶无关,并且也无HB-EGF的剥离释放。6、EGFR和Src抑制剂的作用1μM上皮生长因子受体特异性拮抗剂AG1478能够部分抑制由异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化,而10μM Src酪氨酸激酶抑制剂PP1能够完全抑制此磷酸化过程,差异均具有统计学意义。表明异丙肾上腺素介导的ERK磷酸化,可通过Src酪氨酸激酶直接引起上皮生长因子受体激活,进而引起ERK的磷酸化;并且Src酪氨酸激酶也可能直接激活ERK。讨论传统的cAMP-蛋白激酶途径是以靶细胞内cAMP浓度改变和激活PKA为主要特征。PKA被cAMP激活后,能在ATP存在的情况下使许多蛋白质特定的丝氨酸和/或苏氨酸残基磷酸化,从而调节细胞的物质代谢和基因表达。最近研究发现在哺乳动物细胞,cAMP可直接激活PKA和/或Epac1/2。Epac是一种由cAMP直接激活的交换蛋白,能够进一步激活small GTPases Rap1和Rap2。与Gi/o和Gq蛋白耦联受体所引起的上皮生长因子受体间接激活有所不同,Gs蛋白耦联受体激活ERK的信号传导途径更为复杂。由不同的G蛋白耦联受体激活上皮生长因子受体,其生理功能可完全不同,原因可能有以下两点:1)上皮生长因子受体激活的强度及持续时间不同,Gi/o和Gq蛋白耦联受体所引起的ERK磷酸化,一般发生快,持续时间短,大约在10至20分钟达高峰,然后很快下降至消失;而cAMP引起的ERK磷酸化持续时间较长。2)配体与受体结合时,引起EGFR的二聚化作用,EGFR可以形成同型二聚体,也可以和HER₂、HER₃、HER₄形成异型二聚体。上皮生长因子受体间接激活的信号传导途径不仅取决于G蛋白耦联受体的种类,而且也依赖于细胞的种类。随着研究的不断深入,人们发现Gs蛋白耦联受体的激活在某些细胞,如PC12细胞,也能引起上皮生长因子受体的激活,而在另一些细胞,如成纤维瘤细胞和血管平滑肌细胞,cAMP则抑制ERK的磷酸化。即使同样是β₂-肾上腺素受体激活所引起的ERK磷酸化,在COS细胞此磷酸化是由β₂-肾上腺素受体的Gs蛋白转变成Gi蛋白所引起,而且不能被cAMP所替代;而在淋巴瘤细胞ERK磷酸化是通过Epac1/Rap1信号通路完成的。在星形胶质细胞情况则更为复杂,cAMP、Epac1/2、Src和EGFR可能都参与了异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化。结论在星形胶质细胞,β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素与β-肾上腺素受体结合后,催化GS蛋白,使细胞内cAMP浓度增高,进而激活Epacs,通过与Src酪氨酸激酶有关的途径直接引起上皮生长因子受体的激活,进一步引起ERK磷酸化:并且Src酪氨酸激酶也可能直接激活ERK。