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目的:本研究基于中医学“脾主肌肉”理论,试将其中肌肉的内涵同胃这一内在肉质器官相联系,结合前期研究,通过建立冰乙酸所致大鼠胃溃疡(gastric ulcer,GU)模型,藉以探讨究九味益胃合剂对GU大鼠胃黏膜的修复作用及其对MEK/ERK信号通路的影响。方法:选用SPF级SD雄性健康大鼠66只,饲养于SPF屏障环境中,适应性喂养7日后,随机选取12只作为预给药组(Y),给予九味益胃合剂灌胃,余大鼠给予生理盐水灌胃;7日后,再随机选取12只作为空白对照组(K),将除外空白对照组的大鼠,均参照Okabe等的冰乙酸致大鼠GU方法复制动物模型。造模后第3日,自空白对照组、预给药组及尚未分组的大鼠中各随机选取2只,处死取胃,观察造模是否成功。将造模成功、尚未分组的剩余40只大鼠,随机分为模型组(M)、九味益胃组(J)、健脾益气组(P)及铝碳酸镁组(L),加之预给药组(Y)和空白对照组(K),共计6组,每组均为10只,同时开始灌胃给药,药物干预28天,末次给药后禁食24h处死大鼠,采集血液并留取胃组织样本。应用HE染色观察大鼠溃疡边缘组织病理变化,并测定黏膜肌层缺损宽度、再生黏膜厚度;ELISA法测血清SDH、TFF3含量及胃组织匀浆TGF-α含量;免疫组化法测胃组织PCNA、EGFR、ZO-1、Occludin蛋白表达水平;Western Blot检测溃疡边缘组织Cyclin D1及MEK、ERK表达;RT-PCR法检测溃疡边缘组织MEKmRNA、ERKmRNA表达。结果:(1)对再生黏膜厚度与黏膜肌层缺损宽度的影响:空白对照组胃黏膜形态结构正常,模型组胃黏膜变薄并伴见显著形态学病理改变,各治疗组黏膜形态结构基本正常。与模型组比较,各治疗组再生黏膜厚度显著升高(P<0.01),同时黏膜肌层缺损宽度显著降低(P<0.01);与铝碳酸镁组比较,九味益胃组、健脾益气组再生黏膜厚度同黏膜肌层缺损宽度均无统计学差异(P>0.05);九味益胃组、健脾益气组及铝碳酸镁组再生黏膜厚度均显著小于预给药组(P<0.01),黏膜肌层缺损宽度均显著大于预给药组(P<0.01)。(2)对增殖相关因素的影响:与空白对照组比较,模型组PCNA表达量增加(P<0.05),其余各组PCNA表达亦显著增加(P<0.01);与模型组比较,各治疗组PCNA表达增加(P<0.05或P<0.01);与铝碳酸镁组比较,九味益胃组、健脾益气组PCNA表达无统计学差异(P>0.05);与预给药组比较,九味益胃组、铝碳酸镁组PCNA表达无统计学差异(P>0.05),高于健脾益气组(P<0.05)。与空白对照组比较,其余各组Cyclin D1表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,各治疗组Cyclin D1表达增加(P<0.01);铝碳酸镁组Cyclin D1表达显著低于九味益胃组及预给药组(P<0.01),高于健脾益气组(P<0.05);预给药组Cyclin D1增加量高于健脾益气组(P<0.05),而与九味益胃组无统计学差异(P>0.05)。(3)对黏膜修复相关胃肠肽表达的影响:(1)与空白对照组比较,其他各组TGF-α与EGFR表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,各治疗组TGF-α与EGFR表达显著增加(P<0.01);与铝碳酸镁组比较,九味益胃组、健脾益气组TGF-α与EGFR表达无统计学差异(P>0.05);九味益胃组、健脾益气组及铝碳酸镁组TGF-α与EGFR表达不及预给药组,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)与空白对照组比较,其他各组TFF3表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,各治疗组TFF3表达显著增加(P<0.01);各治疗组组间比较,血清TFF3表达均无统计学差异(P>0.05)。(4)对胃黏膜紧密连接相关蛋白表达的影响:与空白对照组比较,模型组、九味益胃组及健脾益气组ZO-1、Occludin表达均降低(P<0.01),铝碳酸镁组及预给药组则无统计学差异(P>0.05);与模型组比较,各治疗组ZO-1、Occludin表达均显著增加(P<0.01);与铝碳酸镁组比较,预给药组ZO-1、Occludin表达无统计学差异(P>0.05);九味益胃组与健脾益气组ZO-1、Occludin表达均低于铝碳酸镁组与预给药组(P<0.05)。(5)对线粒体功能相关标志物SDH表达的影响:与空白对照组比较,预给药组、九味益胃组及健脾益气组SDH表达无统计学差异(P>0.05),而均高于模型组及铝碳酸镁组(P<0.01);与模型组比较,各治疗组SDH表达均显著增加(P<0.01);九味益胃组、健脾益气组与预给药组组间比较无统计学差异(P>0.05),均高于铝碳酸镁组(P<0.01)。(6)对MEK/ERK表达的影响:(1)对MEK、ERK蛋白表达的影响:与空白对照组比较,模型组p-MEK、p-ERK灰度比值降低(P<0.01),余各组均升高(P<0.01);与模型组比较,九味益胃组、健脾益气组、铝碳酸镁组及预给药组p-MEK、p-ERK灰度比值升高(P<0.01);铝碳酸镁组p-MEK灰度比值低于九味益胃组(P<0.05),且高于健脾益气组与预给药组(P<0.01);预给药组p-MEK灰度比值,低于九味益胃组,且高于健脾益气组(P<0.01);铝碳酸镁组与预给药组p-ERK灰度比值无统计学差异(P>0.05),均高于九味益胃组及健脾益气组(P<0.01)。与空白对照组比较,模型组MEK、ERK表达降低(P<0.01),余各组均升高(P<0.01);与模型组比较,各治疗组MEK、ERK表达均升高(P<0.01);铝碳酸镁组MEK表达低于九味益胃组,且高于健脾益气组(P<0.01),与预给药组比较无统计学差异(P>0.05);预给药组MEK表达低于九味益胃组,且高于健脾益气组(P<0.01)。铝碳酸镁组ERK表达低于九味益胃组及预给药组,且高于健脾益气组(P<0.01);预给药组ERK蛋白表达高于健脾益气组(P<0.01),与九味益胃组比较无统计学差异(P>0.05)。(2)对MEK、ERK基因表达的影响:与空白对照组比较,模型组MEKmRNA与ERKmRNA扩增倍数均降低(P<0.05);与模型组比较,各治疗组MEKmRNA与ERKmRNA扩增倍数均升高(P<0.05);与铝碳酸镁组比较,预给药组、九味益胃组、健脾益气组MEKmRNA与ERKmRNA扩增倍数均无统计学差异(P>0.05);与预给药组比较,九味益胃组、健脾益气组MEKmRNA与ERKmRNA扩增倍数均无统计学差异(P>0.05)。结论:1.九味益胃合剂有助于修复冰乙酸所致GU胃黏膜病理损伤,增加再生黏膜厚度,并减轻黏膜肌层缺损宽度。2.九味益胃合剂可增加细胞增殖相关因子PCNA、Cyclin D1表达,这可能是其促进黏膜细胞增殖、修补黏膜结构缺损的机制。3.九味益胃合剂可增加维持胃肠道黏膜结构及参与损伤后修复进程的胃肠肽TGF-α、TFF3表达,活化EGFR,提示其参与溃疡修复的作用,可能与增加TGF-α与TFF3表达相关,参与调节黏膜修复过程中的细胞增殖、迁移进程。4.九味益胃合剂增加黏膜上皮紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin的表达,预给药干预则能进一步增强这一趋势,提示九味益胃合剂能够在一定程度上加强紧密连接的结构,增强黏膜机械屏障功能,不仅在GU的修复,还对于其预防均具有一定的优势。5.九味益胃合剂能增加胃组织线粒体功能相关标志物SDH表达,提示以健脾为主的治法可以增强线粒体功能,提示具有健脾功效的方药,能增强脾之功能,这可能有助于GU修复。6.九味益胃合剂上调胃组织MEK与ERK表达,其促进溃疡修复的作用机制可能在于提高胃组织相关胃肠肽作用,激活MEK/ERK通路,启动黏膜细胞的增殖、迁移进程,实现促进胃组织的缺损填复及结构重塑。7.九味益胃合剂全方组综合指标优于其拆方的健脾益气药组,提示本方防治GU的作用虽然以脾为中心,但仍是多靶点、复合性的,这与从病证结合角度以“胃疡”认识GU发病所涉及的多因素基本切合。本研究提示九味益胃合剂防治GU的机制可能与增加相关胃肠肽表达、激活MEK/ERK通路、促进黏膜细胞增殖、增强黏膜机械屏障等作用相关,在一定程度上为将脾所主肌肉的内涵,同胃体肌肉的生长与修复相联系,并用以指导GU的防治提供了一些思路。