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目的:探讨丙肝非结构蛋白NS4B在上皮细胞间质改变中所起的作用,以及其分子机制。方法:1.用高保真Taq酶从含有全长1b型HCV质粒中扩增出NS4B片段,运用Eco RI和Bam HI双酶切法构建重组的PEGFPC1-NS4B质粒,q RT-PCR、Westernblot、细胞免疫荧光方法检测质粒是否可在真核细胞表达丙肝NS4B蛋白;2.用阳离子脂质体将空质粒和重组质粒转染进入HepG2细胞中进行表达,或在HepG2细胞中分别转染空质粒,1μg,3μg,5μg重组质粒,48h后,q RT-PCR、Western blot来检测E-cadhrin、N-cadherin基因和蛋白表达变化,以观察HepG2细胞是否发生上皮细胞间质改变;3.与2中相同的方法检测HepG2细胞中转录因子Snail基因和蛋白变化,并且通过sh RNA沉默snail的表达以观察snail在丙肝NS4B导致的上皮细胞间质改变中所起的作用;4.用细胞划痕实验观察转染了丙肝NS4B重组质粒及共转染重组质粒和Snail sh RNA的HepG2细胞迁徙能力的改变;5.Westernblot检测Scribble-Hippo-PI3K/AKT信号通路变化,以探究丙肝NS4B蛋白引起上皮细胞间质改变分子机制。结果:1.测序及双酶切鉴定结果显示读码框和插入方向完全正确,并且在两端成功插入了起始密码子和终止密码子,双酶切片段结果为4725bp和796bp长度两个片段,鉴定结果显示目的基因已经插入PEGFPC1空质粒中,重组PEGFPC1-NS4B质粒可在HepG2细胞中瞬时表达。2.转染了重组NS4B质粒的HepG2细胞相较于对照组而言,q RTPCR显示E-cadhrin m RNA表达下调、N-cadherin m RNA表达上调。Western blot结果显示E-cadhrin蛋白水平表达下调、N-cadherin蛋白水平表达上调。同时E-cadhrin的蛋白表达随着丙肝NS4B表达的增加而减少,N-cadherin蛋白的表达随着丙肝NS4B表达的增加而增加,说明NS4B蛋白表达是引起上皮细胞间质改变的根本原因。3.转染了重组NS4B质粒的HepG2细胞相较于对照组而言,Westernblot结果显示转录因子Snail表达上调,且Snail随着丙肝NS4B蛋白表达增加而增加,但q RT-PCR结果显示表达丙肝NS4B组和对照组其snail m RNA表达水平相差不大,说明Snail蛋白变化发生于转录后水平;沉默snail表达可扭转HepG2细胞上皮细胞间质改变。4.转染了重组NS4B质粒的HepG2细胞迁徙能力较未转染组增强,而共转染NS4B质粒和Snail sh RNA的HepG2细胞迁徙能力并未明显增加。5.转染了重组NS4B质粒的HepG2细胞与对照组相比,可与Scribble蛋白相互作用并导致其表达下调,Scribble下游Hippo信号通路中pyap蛋白表达下调,但total-yap表达无明显变化,p-yap/total-yap减少,Hippo信号通路被抑制,而p-akt表达上调,total-akt表达下调,p-akt/total-akt表达增加,说明Hippo下游通路PI3K/AKT信号通路被激活,这可能是丙肝NS4B导致肝细胞上皮细胞间质改变的分子机制。结论:丙肝非结构蛋白NS4B通过上调转录因子Snail的表达进而导致肝细胞上皮细胞间质改变,且可能通过Scribble-Hippo-PI3K/AKT通路引起Snail表达变化。