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【研究背景及目的】肺癌长期以来一直是全世界死亡率最高的癌症,其中非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)约占全部肺癌的80%。大多数患者在诊断出肺癌时已经处于晚期,这意味着肿瘤细胞此时已经转移或具有了浸润和转移的特征。上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移过程中发生的一项关键事件。转化生长因子-β(Transforming growth factor beta,TGF-β)是一类具有多种功能的细胞因子,其调控着多种多样的细胞生理功能,如细胞增殖、分化、凋亡及EMT。许多证据表明TGF-β信号通路所介导的EMT在人类恶性肿瘤细胞的侵袭及转移过程中发挥重要作用。SMAD3/4蛋白作为TGF-β信号通路的重要成员,能够被TGF-β受体磷酸化激活,进一步入核转录调控下游相关基因的表达,其中包括EMT相关蛋白E-cadherin、Snail、N-cadherin、Vimentin等等。mi RNA能够在转录后水平调控基因的表达,人类大部分基因的表达都可能受到miRNA的直接靶向调控。近期研究表明,mi R-203和miR-145与非小细胞肺癌和鼻咽癌的细胞侵袭相关。同时,有文献报道miR-205在肺癌中下调表达,表现出抑癌基因的特性。预测分析显示,SMAD3是miR-203和miR-145的靶基因,而SMAD4是miR-205的靶基因。尽管如此,上述miRNA是否参与了TGF-β诱导的NSCLC细胞的EMT进程、是否能够影响NSCLC的侵袭和转移还有待证实。【研究方法】1)qRT-PCR检测mRNA和miRNAs的表达;western blot analysis检测蛋白的表达情况;2)利用mi RNA mimics瞬时转染细胞获得相应过表达miRNA的细胞模型。3)构建含有靶基因转录本3’非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)特定种子序列的双荧光报告载体psiCHECK2,Dual-luciferase检测miRNA与转录本3,UTR预测位点靶向作用关系;4)利用Transwell细胞迁移侵袭实验来检测细胞侵袭能力的变化;【研究内容】第一部分miR-145和miR-203下调SMAD3进而抑制NSCLC细胞中TGF-β介导的EMT进程。1)SMAD3在NSCLC细胞和组织中均上调表达,而miR-145和miR-203在NSCLC细胞和组织中均下调表达;2)miR-145和miR-203均能够特异性靶向作用SMAD3转录本3’-UTR区域,从而抑制SMAD3的表达;3)在NSCLC细胞株中miR-145和miR-203抑制了TGF-β诱导的EMT和细胞迁移侵袭能力,而抑制miR-145或miR-203促进了TGF-β诱导的EMT和细胞迁移和侵袭能力;4)在NSCLC中siRNA沉默SMAD3的表达抑制了TGF-β诱导的EMT和细胞迁移侵袭能力。第二部分miR-205靶向抑制SMAD4从而抑制TGF-β诱导的NSCLC细胞的EMT进程。1)在A549细胞中利用siRNA靶向沉默SMAD4的表达,抑制了TGF-β诱导的EMT、细胞迁移和侵袭能力。2)双荧光报告实验证实,miR-205靶向作用SMAD4转录本3’-UTR 262-269种子区域,从而抑制SMAD4的表达。3)miR-205抑制了TGF-β/SMAD4信号介导的A549细胞的EMT和迁移侵袭能力。【结论】在非小细胞肺癌中,miR-145和miR-203通过靶向抑制SMAD3的表达来抑制TGF-β诱导的EMT和细胞侵袭能力。同时,miR-205可以通过靶向抑制SMAD4的表达来阻碍TGF-β诱导的EMT和细胞侵袭能力。本研究为NSCLC细胞中TGF-β诱导EMT的基于miRNA调控机制提供了新的视角,同时也对靶向治疗NSCLC具有一定指导意义。