转基因玉米3272检测方法及质粒标准分子构建

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为了保障我国乃至全球转基因产品标识管理制度的顺利实施,本文主要从两个方面开展了转基因产品检测技术的相关研究。 转基因玉米3272品系特异性检测方法的建立:基于转基因玉米3272的3’端旁侧序列设计了品系特异性的引物和探针,通过优化引物、探针等技术参数,建立了品系特异性定性、定量PCR检测方法。并构建了一个适于转基因玉米3272品系特异性单一和复合PCR定性定量检测的质粒标准分子p3272。建立的单一和复合定性PCR检测方法的检测灵敏度(LOD)均为0.05%,相当于25个拷贝玉米单倍体基因组DNA。基于p3272建立的单一和复合荧光定量PCR扩增体系的标准曲线具有很高的反应效率和相关系数,重复性和重演性的标准偏差(SD)值均小于0.2,绝对LOD和LOQ均为10拷贝和25拷贝。同时,在实验室内部组织了5人协同实验对构建的标准分子p3272及其检测方法进行验证。结果显示,利用构建的标准分子及其检测方法获得实际样品定量检测结果与真实值偏差小于25%,相对标准偏差(RSD)值小于25%,表明所构建的标准分子及其品系特异性PCR检测方法完全适用于转基因玉米3272检测。 转基因玉米质粒标准物质研制:利用分子克隆手段,本文构建了适合于转基因玉米GA21、NK603、MON810、MON863、TC1507、Bt11、Bt176、T25品系特异性检测的质粒分子pGA、pNK、p810、p863、pTC、pBt11、pBt176、pT25。每个标准分子中均包含玉米内标准基因zSSIIb序列和对应的外源品系特异性序列,并且在内标准基因和外源品系特异性序列间插入了一段2463bp的特异性DNA片段用于复合PCR检测。本文以质粒标准分子pTC为例,建立了质粒标准物质适合性、均匀性、稳定性、定值和不确定度测定等技术方法和体系。在适合性测试中,pTC针对TC1507玉米具有高特异性,pTC作为检测对照,灵敏度低至为50个拷贝。在均匀性测试中,我们随机抽取了15份pTC样品(106copies/μL),通过测试比较pTC的zSSIIb和品系特异性序列扩增的Ct值、平均拷贝数间的差异,及与总体平均值间的差异等,结果证明15个份样品间的差异无显著水平(p>0.05)。在稳定性测试中,分别设定了在不同贮存温度和保存时间条件下处理pTC质粒标准分子,对其zSSIIb和品系特异性序列扩增的Ct值和拷贝数分析结果显示:在室温和4℃保存四周条件下,pTC质粒DNA稳定;在37℃贮存四周条件下,pTC质粒DNA才有明显的降解趋势。在定值和不确定度测试中,通过测序和荧光定量PCR的方法分析标准分子pTC插入的目标序列之比,利用方差分析估计这个比值的总体不确定度,最后验证得出所插入的TC1507品系特异性序列与玉米zSSIIb序列拷贝数之比为1。
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