论文部分内容阅读
背景与目的：非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease)在全球范围的发病率逐年升高,当前临床上涉及脂肪肝的外科手术,包括脂肪肝作为肝供体的肝脏移植手术都日趋增多。但是临床数据显示与正常肝脏相比脂肪肝的移植以及其他外科手术通常会导致更高比例的肝功能异常及更广泛的并发症。临床多数资料显示与正常肝脏相比,脂肪肝更容易产生严重的缺血再灌注损伤(Ischemia/reperfusion injury),从而导致了脂肪肝的手术效果相对较差,术后并发症较多。一系列研究表明脂肪肝严重的缺血再灌注损伤主要源于氧化应激和炎症反应等损伤效应。茶黄素(Theaflavin)是从红茶提取的一种多酚类物质,经过红茶的研磨、发酵以及层析分离获得。以往关于茶黄素的研究显示其具有降低血脂、降低血胆固醇、抗氧化、抗癌等广泛功能。本实验研究目的：观察小鼠正常肝与脂肪肝缺血再灌注的区别,并且在茶黄素干预过的小鼠脂肪肝模型基础上实施缺血再灌注操作,观察其是否能减轻脂肪肝缺血再灌注损伤,并且研究阐明相关的一系列机制。方法：1.体内实验：将雄性C57BL/6小鼠随机分成3组,每组7只。第一组给予正常饮食,缺血再灌注操作前给予30mg/kg生理盐水3次腹腔注射处理；第二组给予缺乏蛋氨酸及胆碱的高脂肪饮食(Methionine and choline-deficient high fat diet),缺血再灌注操作前给予30mg/kg生理盐水3次腹腔注射处理；第三组给予缺乏蛋氨酸及胆碱的高脂肪饮食,缺血再灌注操作前给予30mg/kg茶黄素3次腹腔注射处理。正常饮食及高脂肪饮食均为14天。生理盐水或茶黄素于缺血再灌注前48小时、24小时、2小时进行3次腹腔注射,然后夹闭门静脉给予15分钟的缺血及恢复再灌注3小时。接着处死实验小鼠,取肝组织和血清。检测血清ALT、AST,肝组织Thiobarbituric acid-reactive subtance(TBARS),作肝组织HE病理检查,TUNEL、MPO及F4/80免疫染色检查,并对肝组织TNF-a、IL-6、iNOS、osteopontin进行实时定量RT-PCR分析,观察各因子的变化情况。2.体外实验：对正常肝及脂肪肝的实验鼠分别进行在体肝脏灌流,分离及培养正常肝细胞及脂肪肝细胞,检测24小时内两组细胞活性氧(reactive oxygen species)的含量。并将脂肪肝细胞和正常肝细胞随机分成多组,以DMEM溶液添加各种浓度的茶黄素后进行细胞培养,细胞培养12小时后,检测并比较各组细胞生成胞内活性氧的含量。利用小鼠巨噬细胞细胞株RAW264.7细胞进行细胞培养,并随机分成处理组和对照组。处理组以DMEM溶液添加0.1ng/ml脂多糖及0.1μg/ml茶黄素培养12小时,对照组以DMEM溶液添加0.1ng/ml脂多糖培养12小时,然后通过TNF-α的ELISA试剂盒及分光光度计检测两组细胞产生TNF-α的水平。结果：1.14天MCD饮食可以导致小鼠大泡性脂肪肝产生,而茶黄素处理组可以有效减轻脂肪肝面积比例。2.在缺血再灌注过程中,脂肪肝小鼠较正常小鼠产生更高的血清ALT、AST以及肝组织TBARS水平,而经茶黄素干预后,血清ALT、AST及肝组织TBARS水平均明显下降。3.脂肪肝的缺血再灌注较正常肝的缺血再灌注产生明显增加的TUNEL阳性肝细胞数量,而经茶黄素干预的脂肪肝缺血再灌注TUNEL阳性肝细胞显著减少。4.脂肪肝的缺血再灌注较正常肝的缺血再灌注产生明显增加的F4/80阳性细胞数量,而经茶黄素干预的脂肪肝缺血再灌注F4/80阳性细胞显著减少。5. MPO免疫染色显示脂肪肝的缺血再灌注与正常肝相比无明显差异,茶黄素干预后也无明显改变。6.实时定量RT-PCR的结果显示脂肪肝的缺血再灌注较正常肝产生显著增加的TNF-α、IL-6、iNOS、osteopontin等炎症因子的mRNA水平,而经茶黄素干预后,上述炎症因子的mRNA水平均显著下降。7.在体外培养过程中,不同时间点检测均显示脂肪肝细胞较正常肝细胞产生更多的活性氧,而经茶黄素处理的脂肪肝细胞活性氧含量明显下降。8. ELISA检测的结果显示LPS可刺激RAW264.7细胞产生显著增高的TNF-α水平,而茶黄素能有效抑制LPS刺激RAW264.7细胞产生TNF-α。结论：与小鼠正常肝相比,小鼠脂肪肝会产生更严重的缺血再灌注损伤,而多次腹腔注射茶黄素可以显著减轻脂肪肝缺血再灌注损伤,其机制可能是通过抑制活性氧产生、减少肝细胞凋亡、抑制巨噬细胞活化和浸润以及减少相关炎症因子的产生来发挥作用。