【摘 要】
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背景胆红素脑病（Bilirubin encephalopathy,BE）是一种发生于新生儿的神经系统综合征,主要是由未结合胆红素（Unconjugated bilirubin,UCB）产生过量氧化应激产物引起神经元损伤而致病。在多种中枢神经系统性疾病如脑出血、脑缺血中发现,脑红蛋白（Neuroglobin,NGB）可通过抑制氧化应激损伤引起的凋亡反应,从而对脑组织起到保护作用,但NGB在BE脑中的
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背景胆红素脑病（Bilirubin encephalopathy,BE）是一种发生于新生儿的神经系统综合征,主要是由未结合胆红素（Unconjugated bilirubin,UCB）产生过量氧化应激产物引起神经元损伤而致病。在多种中枢神经系统性疾病如脑出血、脑缺血中发现,脑红蛋白（Neuroglobin,NGB）可通过抑制氧化应激损伤引起的凋亡反应,从而对脑组织起到保护作用,但NGB在BE脑中的表达变化及其意义尚不明确,阻碍了NGB在BE治疗中的应用。电针（electroacupuncture,EA）作为传统中国医学的一部分,已被证实能够通过上调NGB的表达以在神经退行性疾病、缺血缺氧性脑病等中枢神经系统疾病中起到保护作用。本研究旨在探讨急性胆红素脑病造模后不同时间点大脑颞叶皮质NGB的表达变化规律,并通过电针刺激介导BE模型中大脑颞叶皮质区域NGB的表达变化及凋亡相关蛋白的表达变化,以探究NGB对BE中脑组织的保护作用机制及电针对BE治疗的应用前景。方法将75只7日龄SD乳鼠分为假手术（Sham）组、BE模型组,经小脑延髓池注射胆红素溶液（10μg胆红素/g体重）,以建立新生儿BE模型,并根据胆红素作用时间的不同,将BE模型组分为6 h、12 h、24 h、7 d组、28 d组,其中28 d组仅用于神经行为学评分及罗塔罗德实验,假手术组注射等量生理盐水作为对照。通过选取假手术组乳鼠5只及模型组乳鼠5只进行各时间点体重监测,并将假手术组及BE模型组乳鼠喂养至28天,进行神经行为学评分及罗塔罗德实验,以验证我们实验模型是否成功,通过HE和尼氏（Nissl）染色、透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察各组大鼠大脑颞叶皮质的病理变化及神经元及星形胶质细胞的超微结构改变;应用免疫荧光染色技术检测NGB的表达部位及确定其表达的细胞种类;使用免疫印迹、定量PCR技术检测各组大鼠大脑颞叶皮质中NGB及其m RNA的表达,使用免疫印迹技术检测各个时间点模型组及假手术组线粒体凋亡信号通路相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyto c、Caspase-3的表达量变化。并以NGB表达最高时间点的SD乳鼠作为研究对象,对BE乳鼠进行电针治疗,将39只7日龄SD大鼠分为假手术（Sham）组、BE模型组、电针治疗（BE+EA）组。BE+EA组选取百会穴与曲池穴以频率2/15 Hz的疏密波,于造模前12 h、造模完成时及造模后12 h进行三次电针干预,每次15 min。使用HE、尼氏（Nissl）染色及透射电镜检测各组鼠脑颞叶皮质的病理变化及神经细胞超微结构的改变;应用免疫荧光染色法检测各组鼠脑颞叶皮质NGB的表达部位,并确定其表达的细胞种类;通过免疫印迹法检测各组鼠脑颞叶皮质中NGB蛋白及PI3K/AKT通路、线粒体凋亡信号通路相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyto c、Caspase-3的表达量;使用Tunel染色对各组凋亡细胞的数量进行检测。结果与假手术组乳鼠相比,BE模型组乳鼠总体体重较假手术组乳鼠降低,神经行为学评分显示BE模型组乳鼠评分明显高于Sham组乳鼠,并且罗塔罗德实验发现BE模型乳鼠从加速旋转棒上跌落的时间明显低于Sham组乳鼠;HE及Nissl染色结果显示各时间点BE模型组乳鼠脑颞叶皮质神经元均有不同程度的病理损伤及超微结构的改变,并且在24 h损伤最严重,HE及Nissl染色显示大量神经元染色模糊不清,尼氏小体数量减少,电镜显示神经元线粒体肿胀在各组中最严重;WB及q PCR结果显示BE模型组乳鼠脑颞叶皮质中NGB的表达均有所增加,并在12 h达到高峰,随后逐渐下降;免疫荧光结果显示NGB主要表达于脑颞叶皮质当中,并仅与神经元共定位;对各组乳鼠进行凋亡相关蛋白的WB检测证实,随着时间增加,BE模型乳鼠脑颞叶皮质神经细胞凋亡逐渐加重,在24 h达到高峰。而EA治疗后,HE及Nissl染色显示与BE模型组相比,BE+EA组乳鼠脑颞叶皮质神经元病理损伤缓解,神经元中线粒体水肿减轻;WB及免疫荧光结果显示BE+EA组乳鼠脑颞叶皮质NGB表达较BE模型组进一步增加,促凋亡蛋白Bax、Cyto c、Caspase-3表达降低,Bcl-2/Bax比值上调,PI3K/AKT通路相关蛋白p AKT Ser473、PI3K p110α表达增高;Tunel染色显示电针刺激后凋亡细胞数量减少。结论BE中胆红素的神经毒性作用将促使大脑颞叶皮质中NGB表达量随胆红素的作用时间而逐渐增加,至12 h达高峰,而凋亡在24 h达到高峰,NGB的这种反应性增高可能并不能有效的对脑组织起到保护作用,最终导致细胞凋亡不可避免的发生;而EA可通过促进内源性NGB的表达并激活PI3K/AKT通路以抑制凋亡的发生,进而起到对神经细胞的保护作用。因此,电针可能成为BE的一种潜在的治疗方法。
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