HIV-1整合酶和蛋白酶ELISA检测方法的建立及与逆转录酶检测方法联合应用研究多靶位HIV抑制剂

来源 :中国协和医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xong916
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艾滋病自1981年发现以来在全世界迅速蔓延,形成现代瘟疫,我国自1985年发现第一例艾滋病人,HIV感染目前已进入快速增长期,每年以30%的惊人速度增长,扩展到全国31省市,对人们的健康造成了巨大的威胁。因此遏制艾滋病的流行,是当前的迫切任务。HIV pol基因编码的三个酶—逆转录酶,蛋白酶和整合酶在HIV复制过程中起关键作用,是抗HIV药物的理想靶点。已成功地发展了10种逆转录酶抑制剂和6种蛋白酶抑制剂用于临床。但这些药物作用靶位单一,单独使用极易产生耐药性,联合应用两类抑制剂的“高效抗逆转录病毒疗法”(HAART)对艾滋病的治疗虽取得了很大的成功,但不能清除病毒,停药后病毒载量反跳,且毒副作用大,价格昂贵,难于推广应用,至今尚未能控制艾滋病的流行,不断寻找新抗HIV药物是长期艰巨的任务。 整合酶在HIV的复制周期中特异性切割掉病毒3′端两个核苷酸,并随机切割宿主细胞染色体DNA,将病毒cDNA整合于宿主细胞DNA随着宿主的复制而复制,是HIV在体内长期潜伏的主要原因。近年来寻找HIV整合酶抑制剂受到广泛重视,但由于HIV整合酶仅核心部分立体结构得到阐明,不利于进行计算机辅助设计,32P同位素标记的检测方法不适于大量筛选,虽已有一些HIV整合酶抑制剂在临床试验,但至今尚未批准作为药物。本文为促进HIV整合酶抑制剂的发展,引进含有HIV-1整合酶基因的表达质粒IN F185K/C280SIN1-288,表达重组HIV-1整合酶融合蛋白,在国内首次建立其ELISA快速检测方法,用合成的类似于病毒U5LTR 3′端的30bp的寡核苷酸为供体底物,生物素标记的20bp的人工合成的寡核苷酸作为靶底物,在体外反应体系中,重组的整合酶可以发挥酶3′切割和链转移活性而将靶底物与供体底物整合,利用亲利素标记的碱性磷酸酶显色系统对产物进行定量(酶标仪测A405nm)。经验证,ELISA方法重现性稳定性特异性好,适用于抑制剂的快速筛选和药效评价。HIV整合酶ELISA方法可将整合过程分解为三步,分别测
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