研究目的:微透析(Microdialysis,MD)技术是近年来新兴的一种生物活体取样技术,它是利用物质沿浓度梯度扩散和半透膜对小分子化合物具有通透性的原理设计的,具有原位取样、实时、在线、无需样品预处理、动态检测等特点。其与色谱分析仪器联合应用为体内药物分析开辟了高效、精确、简便的新途径。目前国外微透析技术已经与多种色谱分析仪器进行了在线联用,形成了标准化商品,但其设备价格昂贵,国内均依靠进口,欲在我国推广这一新的分析技术,设备的国产化势在必行。中药经皮给药系统在我国历史悠久,目前评价中药及其有效成分经皮给药的研究系统最常用的方法是应用Franz扩散池测定药物的透皮速率,以此来预测药物的生物等效性。但Franz扩散池存在一些不足,如不能满足溶液流体动力学、离体皮肤的物理化学结构和生理条件发生显著差异等,都影响实验数据的准确性与科学性。因此将自行研制与构建微透析与液相色谱在线联用技术应用到中药经皮给药的体内药动学与代谢研究中,克服了以往研究方法的不足,为开展这一新技术创造了条件,提供了可靠和全新的手段。同时也为中药现代化研究与中药的质量控制提供了的先进、可行的新技术。研究方法与结果:1葛根素高效液相色谱条件的建立与离体大鼠皮肤体外渗透性实验研究本研究建立了测定葛根素的高效液相色谱方法。色谱柱:Hypersil C18柱(5μm, 4.6 mm×150 mm);紫外检测波长:251 nm;流动相:甲醇:水(含0.1%醋酸)(30:70);流速:1min·mL-1;柱温:室温:25±0.1oC。药物浓度与峰面积之间成良好线性关系。方法精密度好、准确度高,符合分析要求。采用改良Franz竖直扩散池,以卡波姆、氮酮为辅料制备葛根素凝胶剂,离体大鼠皮肤为透皮屏障,用HPLC法测定葛根素的累积渗透量。实验结果表明,葛根素凝胶剂体外透皮释药时间累积透过量拟合方程:Q = 11.12t -45.18 r =0.9635,32 h累积渗透量为335.18±51.45μg/cm2。葛根素以一级动力学透过皮肤,所研制的葛根素经皮给药系统体外渗透性能良好,质量控制方法简便、快捷、准确。2微透析与高效液相色谱技术(离线)联用对葛根素凝胶剂型经皮给药系统的药代动力学研究本研究首次以中药单体葛根素模型药物,采用微透析取样与高效液相色谱分析(离线)联用技术(MD-HPLC off-line),考察了其微透析探针体内外回收率,继而进行了葛根素凝胶剂经皮给药系统的皮肤药代动力学和代谢过程的研究。所得数据经kinetica软件处理,得到葛根素经皮给药后皮下葛根素浓度-时间曲线图。其中药时曲线下面积为(AUC) 2335.14 ug·min·mL-1,半衰期为(T1/2) 230.515 min,消除速率常数为(Lz) 0.003,最大血药浓度为(Cmax) 4.62277 mg/mL与其所对应的时间为(Tmax) 460 min。3微透析与高效液相色谱在线联用技术平台的构建本研究在国内率先自行研制与构建微透析与高效液相色谱在线联用平台(MD- HPLC on-line),采用10孔自动进样阀将微透析设备与高效液相色谱系统,通过聚丙烯、聚醚醚酮、弹性熔融石英毛细管三种材质的管路,经美国CYBERBOND (Apollo)瞬间生物兼容性粘合剂粘合而联为一体。实现软件联动,最终达到10孔自动进样阀进样的同时,高效液相色谱系统检测器对样品同时进行监测,仪器性能数据应用SPSS软件,配对T检验对3种浓度(0.1 ug/mL,10 ug/mL,100 ug/mL)的葛根素出峰时间理论值与实测值,进行统计学分析,P 0.1=0.239,P 10=0.617, P 100=0.809,P值均大于0.05,无统计学意义,既葛根素的理论值和实测值没有显著性差异。因此得出结论,本实验建立的VCOM和CLASS-VP软件分别控制10孔自动进样阀和HPLC系统,可以做到进样和检测同步完成,仪器精密、准确,完全可以达到实验的要求,实现了微透析取样与高效液相色谱检测在线联动。仪器设备价格低廉、简便实用,经济可靠。这将成为国内第一台自行构建并投入实用的在线联用装置,为推动这一新技术在我国的广泛应用奠定了基础。4微透析与高效液相色谱离线与自制在线联用平台性能的考察与比较本研究以葛根素为模型药物,测定MD-HPLC off-line与自制的MD-HPLC on-line的仪器精密度、重现性、稳定性等相关参数,考察MD-HPLC on-line仪器性能,发现与解决存在的问题,进一步改进与完善该系统,数据经SPSS 13.0统计软件分析,具体结果如下所示:1)回归方程中相关系数(r在线=r离线=1),回归系数(b在线=31304,b离线=29369)分别进行F检验(F在线=168959.6,P在线=0.0001,F离线=71114.847,P离线=0.0001)和t检验(t在线=411.047,P在线=0.0001,t离线=266.674,P离线=0.0001),P值均小于0.05。结果提示,在线和离线回归方程中相关系数、回归系数本身具有统计学意义,且自行研制的MD-HPLC on-line测定浓度和葛根素峰面积的相关性与MD-HPLC off-line无明显差异。进一步对两回归方程中的回归系数进行F检验,反应其差值是否具有统计学意义。采用General linear model观察其交互性参数,F=208.967,P=0.0001,P值均小于0.05,有统计学意义。结果提示,自行研制的MD-HPLC on-line与MD-HPLC off-line测定同一浓度葛根素样品时,MD-HPLC on-line所测得的峰面积响应值优于MD-HPLC off-line。2)精密度(日内)数据经两组比较t检验分析:t 0.1=46.862,P 0.1=0.0001;t 10=5.035,P 10=0.001;t 100=7.090,P 100=0.0001,P值均小于0.05,且3种浓度葛根素峰面积SD在线<SD离线。结果提示:自行研制的MD-HPLC on-line与MD-HPLC off-line测定低、中、高3种浓度葛根素样品时,MD-HPLC on-line日内精密度优于MD-HPLC off-line,且有统计学意义。精密度(日内)数据经两组比较t检验分析:t 0.1=37.222,P 0.1=0.0001;t 0.1=5.669,P 0.1=0.0001;t 0.1=12.226,P 0.1=0.0001,P值均小于0.05,且3种浓度葛根素峰面积SD在线<SD离线。结果提示:自行研制的MD-HPLC on-line与MD-HPLC off-line测定低、中、高3种浓度葛根素样品时,MD-HPLC on-line日间精密度优于MD-HPLC off-line,且有统计学意义。3)重现性数据经两组比较t检验分析:SD在线=8352.453,SD离线= 22953.676,SD在线<SD离线; t=24.353,P=0.001,P< 0.05。结果提示:自行研制的MD-HPLC on-line和MD-HPLC off-line测定葛根素样品时,MD-HPLC on-line重现性优于MD-HPLC off-line,且有统计学意义。4)稳定性数据经两组配对t检验分析:SD在线= 1741.153,SD离线= 2007.673,SD在线<SD离线;t=7.855,P=0.001,P< 0.05,有统计学意义。结果提示:自行研制的MD-HPLC on-line与MD-HPLC off-line测定葛根素样品时,MD-HPLC on-line稳定性优于MD- HPLC off- line,且有统计学意义。5微透析与高效液相色谱在线联用技术对阿魏酸线性探针的校正本研究首次采用自行研制与构建微透析与高效液相色谱在线联用平台,对见光或受热后极易发生异构化进而降解的中药单体成分阿魏酸进行了线性微透析探针的体内外回收率校正。体外回收率结果:增量法为37.88±1.56 %,减量法为37.11±0.50%;体内回收率结果:减量法为20.69±1.87 %。再次考察和验证MD-HPLC on-line联用平台,同时避免了这类不稳定,易降解的化合物存放中发生的变化,解决了自动分析的问题。为阿魏酸的研究,提供了更加精确、快速、简便的分析测定方法。6微透析与高效液相色谱在线联用技术在中药经皮给药系统体内药物代谢动力学中的应用本研究首次采用自行研制与构建的微透析与高效液相色谱在线联用平台与技术,对大鼠皮下的线性微透析探针与颈静脉中的血管微透析探针同时取样,实现同步、实时、在线监测,以全面反映葛根素凝胶制剂给药后在大鼠皮肤与血液中的葛根素药代动力学代谢过程,数据经Kinetica软件处理分析,得到葛根素凝胶经皮给药后皮下和血管内葛根素浓度-时间曲线图。线性微透析探针:药时曲线下面积为(AUC)3662 ug·min·mL-1,半衰期为(T1/2) 519 min,消除速率常数为(Lz) 0.0018,最大血药浓度为(Cmax) 9.6483 ug/mL与其所对应的时间为(Tmax) 381 min;血管微透析探针:药时曲线下面积为(AUC) 2391.11 ug·min·ml-1,半衰期为(T1/2) 250 min,消除速率常数为(Lz)0.0027,最大血药浓度为(Cmax) 14.6563 ug/mL与其所对应的时间为(Tmax) 48 min。提示葛根素在血液中消除快,而在皮下组织中消除较慢,生物利用度皮下组织稍高于血液。结论:本项目自行研制微透析取样与高效液相色谱在线联用(MD-HPLC on-line)设备,价格低廉、简便实用,把这一新技术的开展引入国内。同时应用这一技术进行具有我国特色的传统中药及其有效成分的经皮给药系统研究,为中药质量可控性、标准化、以及药代动力学与代谢研究提供可靠的科学依据与分析方法。