论文部分内容阅读
目的类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一类慢性自身免疫病,患病人数占世界人口的1%以上。RA患病的主要特征是慢性的炎症反应以及关节软骨和骨的破坏,严重时诱发其它并发症甚至致残。当RA病理过程中,免疫紊乱引起异常的滑膜增生,生成血管翳侵入软骨,进而造成骨及软骨的损伤,病情较重的会使关节病变畸形甚至使患者丧失运动机能。而免疫失调生成的多种细胞因子在RA复杂的病理进程中发挥了不可或缺的作用。这些细胞因子中有的会促使滑膜细胞异常增殖,造成滑膜炎症;有的会通过调控不同的信号通路,增加金属基质蛋白(Matrix metalloproteinase,MMPs)的产生,直接加重关节骨及软骨的损伤。许多研究表明microRNAs(miRNAs)在疾病中发挥调控功能,特别是异常表达的miRNAs参与到RA病理的进程。因而,本课题将miR-145-5p作为研究对象,目的是研究其在RA中对于细胞因子的调控作用以及在RA发生发展中的可能的作用。方法本实验使用Quantitative PCR(qPCR)对30例RA患者和23例正常人的PBMC中miR-145-5p表达量进行测定,比较其表达差异。同时测定其在RA(12例)和骨关节炎(Osteoarthritis,OA)(10例)病人的滑膜组织中的表达差异。之后在RA患者的RA-Fibroblast-like synovial cells(RA-FLS)中过表达miR-145-5p,通过qPCR、Western Blot检测RA-FLS胞内Interleukin(IL)-1β、IL-6、IL-17及MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13)的分子及蛋白水平,再通过ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)实验分析了RA-FLS培养上清液中炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-17)及MMPs(MMP-3、MMP-9和MMP-13)的表达量的变化。然后运用生物信息学软件结合查询资料分析预测miR-145-5p潜在的靶基因,qPCR实验验证miR-145-5p与待测靶基因在mRNA水平的表达相关性,然后用Western blot验证其蛋白表达,最终使用双荧光素酶报告系统来验证miR-145-5p与相关靶基因的靶向关系。结果1.检测RA病人和正常人PBMC中miR-145-5p的表达水平发现,miR-145-5p在RA患者的PBMC中的表达明显高于在正常人PBMC中水平。RA病人的滑膜组织及FLS中miR-145-5p的水平高于在OA病人中的表达。2.过表达miR-145-5p之后测定RA-FLS中IL-1β、IL-6和IL-17分子及蛋白的表达发现,IL-17明显高水平表达,IL-1β、IL-6表达无明显差异。3.过表达miR-145-5p之后测定RA-FLS中MMPs的表达发现,MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达升高,MMP-1表达无变化。4.生物信息学分析推测miR-145-5p的待测靶基因为Ets-1,在RA-FLS中转染miR-145-5p之后,qPCR和Western blot检测Ets-1分子及蛋白水平发现,其分子及蛋白水平在过表miR-145-5p之后降低,敲低miR-145-5p之后升高。5.双荧光素酶报告实验验证miR-145-5p与Ets-1的靶向关系发现,miR-145-5p确实是结合在Ets-1的3’UTR区,结合位点为:为Ets-1的3’UTR的2710位点。结论miR-145-5p在RA患者的PBMC中的表达明显高于在正常人PBMC中水平。RA病人的滑膜组织及FLS中miR-145-5p的水平也高于在OA病人中的表达。RA中高水平的miR-145-5p可能通过靶向调节Ets-1下调了其表达,并且Ets-1可能升高了IL-17表达量,同时升高的IL-17可能通过调节p38 MAP和ERK1/2通路造成MMP-3、MMP-9、MMP-13的水平上调。从而影响RA中细胞因子的调控,对RA的病理进程造成影响。