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在人类肿瘤中p53基因常发生突变(约50%)。在肿瘤细胞中,翻译后修饰和/或热休克蛋白可稳定突变p53,使其不能被泛素化-蛋白酶体和/或自噬介导的途径降解,从而使突变p53具有耐药性、促进肿瘤进程、激活新的靶基因等获得性功能(Gain of function,GoF)。因此,可通过靶向降解突变p53和域转变突变p53的构象来达到治疗肿瘤的目的。黄杨生物碱KBA01是一种生物活性较好的三萜生物碱,在传统运用中作为行气活血、清热解毒、祛湿通络的中药使用。前期研究已经发现KBA01也具有抗肿瘤活性,它可降解内源性和外源性突变p53R273H蛋白表达,同时能使突变p53R273H的构象转变成野生型p53,并激活p53下游靶基因的表达。但是黄杨生物碱KBA01是否只针对具有p53R273H突变的肿瘤细胞发挥其抗肿瘤活性,还有待进一步探究。因此,我们选取不同p53背景的肿瘤细胞株来探究黄杨生物碱KBA01降解突变p53的作用机理。在本课题研究中,我们选用不同突变p53背景的肿瘤细胞株,使用黄杨生物碱KBA01(10μM)处理这些肿瘤细胞12h、24h、48h后,检测这些细胞中SIRT1、p-SIRT1、p53和Acetyl-p53的表达情况。结果表明,KBA01处理突变p53R273H和p53R208K细胞48h后,可明显上调 HT29、MDA-MB-468、SW480 和 MDA-MB-23 1 细胞中 SIRT1 和 p-SIRT1 的表达,降低p53和Acetyl-p53的表达;KBA01处理突变p53R175H和p53L194F细胞后,对SK-BR-3和T-47D细胞中SIRT1、p53及相关蛋白的表达没有影响。此外,我们还利用外源导入的突变p53R273H的H1299-R273H细胞来验证己有实验结果的准确性,KBA01处理细胞48h后获得了与内源性突变p53R273H细胞中相同的实验结果。同时,我们还选取了野生型p53和p53缺失的肿瘤细胞,如结肠癌HCT116(wtp53)细胞和非小细胞肺癌H1299 p53-/-(p53 null)细胞,来验证KBA01是否只针对突变p53或通过调控野生型p53来发挥作用。结果表明,KBA01处理HCT116细胞后没有改变SIRT1、p53及相关蛋白的表达。同时,在H1299 p53-/-细胞中KBA01处理后,SIRT1和p-SIRT1的表达没有改变,没有检测到p53和Acetyl-p53的表达。这些结果显示黄杨生物碱KBA01能特异性上调突变p53R273H和p53R280K细胞中SIRT1和p-SIRT1的表达,同时降低p53和Acetyl-p53的表达。为了探究黄杨生物碱KBA01是否通过上调SIRT1而导致乙酰化突变p53和突变p53的表达降低。通过单独使用SIRT1抑制剂Suramin(30μM)或联合KBA01(10μμM)处理结肠癌HT29细胞24h、48h、72h后,检测细胞中p53和Acetyl-p53的表达情况。结果表明SIRT1抑制剂联合KBA01使用后,可以恢复乙酰化突变p53和突变p53降低的趋势,结果显示KBA01可能是通过上调SIRT1来降低乙酰化突变p53和突变p53的表达。在结肠癌HT29细胞中,使用KBA01(10μM)处理12h、24h、48h后,检测乙酰转移酶p300的表达情况。结果表明,随着时间梯度的增加p300的表达降低。这些结果显示乙酰化修饰对突变p53的稳定性发挥着重要作用,并且KBA01可能打破突变p53的乙酰化和去乙酰化平衡,抑制突变p53乙酰化的发生,进而抑制突变p53的促肿瘤功能。同时我们还探究了 SIRT1上游因子AMPK、JNK和mTORC1是否参与到上调SIRT1表达的调控中。使用 KBA01(10μM)处理HT29 细胞 12h、24h、48h 后,检测 AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK、mTORC1、mTOR、p-mTOR、p70S6K 和 p-p70S6K 的表达情况。结果表明,随着时间梯度的增加这些蛋白的表达均降低,在48h时降低效果最明显。但是,KBA01没有上调AMPK和JNK的表达。我们推测KBA01是通过降低mTORC1的表达上调SIRT1,而抑制p70S6K的磷酸化来抑制肿瘤的生长。同时我们还利用能特异性识别突变型p53的PAb240和识别野生型p53的PAb1620抗体来验证KBA01是否具有转变其他突变p53肿瘤细胞的构象,同时恢复突变p53的DNA结合和转录激活功能。因此,使用KBA01(10μM)处理具有突变p53R273H或p53R280K细胞48h后,检测这些细胞中PAb240和PAb1620的荧光表达情况。结果表明,KBA01处理后,可减少这些细胞中PAb240的荧光表达量,增加PAb1620的荧光表达量。我们采用KBA01(10μM)处理具有突变p53R175H细胞48h后,结果表明,KBA01处理后,没有改变细胞中PAb240的荧光表达量,没有检测到PAb1620的表达。此外,使用KBA01处理具有外源性突变p53R273H的H1299-R273H细胞来进行验证。结果表明,KBA01处理后,可减少细胞中PAb240的荧光表达量,增加PAb1620的荧光表达量。同时我们还选用了野生型p53的结肠癌HCT116细胞作为对照组,结果表明,使用KBA01处理后,没有检测到PAb240的表达,而PAb1620的荧光表达量没有改变。进一步使用KBA01(10μM)处理HT29细胞12h、24h、48h,再提取细胞核蛋白,并采用生物素标记的能与野生型p53特异性结合的DNA序列来验证KBA01是否能恢复突变p53R273H的DNA结合活性。结果表明,随着时间梯度的增加,与p53特异性结合的DNA量增多,说明KBA01能恢复突变p53R273H的DNA结合活性。我们还使用KBA01(10μM)处理这些不同p53背景肿瘤细胞12h、24h、48h后,检测这些细胞中p53靶基因PUMA和p21蛋白水平和mRNA水平的表达情况。结果表明,在具有突变p53R273H和p53R280K的细胞中,随着时间梯度的增加PUMA和p21的蛋白和mRNA表达均上调。而在具有突变p53R175H和p53L194F的细胞中,随着时间梯度的增加PUMA和p21的蛋白和mRNA表达没有改变。在具有野生型p53和p53缺失的细胞中,随着时间梯度的增加PUMA和p21的蛋白和mRNA表达没有改变。这些结果表明KBA01能转变突变p53R273H和p53R280K的构象并恢复其DNA结合和转录激活功能。但是,对突变p53R175H和野生型p53没有作用。综上所述,我们对黄杨生物碱KBA01在不同p53背景肿瘤细胞的抗肿瘤机理研究中,发现了在不同突变p53背景下KBA01的作用不同。KBA01能特异的通过上调突变p53R273H和p53R280K肿瘤细胞中sIRT1和p-SIRT1的表达,来降低p53和Acetyl-p53的表达,它还通过抑制上游因子mTORC1上调SIRT1的表达,抑制p70S6K的磷酸化,进而发挥其抑制肿瘤的功能,同时转变这些细胞中突变p53的构象,并恢复p53的DNA结合活性和转录活性。