骨缺损是临床上的常见病症,常规的治疗方法主要包括自体骨移植和异体骨移植,前者有骨来源少,供骨部位易出血和感染细菌等问题,而后者有病毒感染和免疫反应的风险。近年来,采用骨组织工程学修复骨缺损的研究得到了广泛的关注。组织工程学是应用工程学、生物学和化学的原理与方法,修复或重建受损的组织和器官,包括血管、骨、软骨、皮肤和神经等。骨组织工程学利用组织工程支架、种子细胞和生长因子,模拟三维微环境,形成有利于细胞增殖、分化和新组织形成的平台,并可移植入骨缺损部位进行组织再生。PLGA多孔微球支架(PLGA-pMS)是一种优秀的可注射支架,具有创伤小、病人适应性强和可填充不规则缺损等优点。根据文献报道和前期研究发现,PLGA-pMS在两方面有待优化。(1) PLGA-pMS的细胞亲和性较差。PLGA是亲脂性聚合物,导致PLGA-pMS的亲水性差；PLGA的结构中也没有供细胞识别的位点。两者导致种子细胞不能有效地粘附在微球表面。目前,PLGA-pMS的修饰改性方法主要是在微球表面沉积磷灰石,但该方法操作复杂,持续时间长,并且对载药PLGA-pMS有不利影响。(2) PLGA-pMS中的药物释放过快。非多孔的PLGA微球是常用的药物缓释载体,体外药物释放一般可达到一个月以上,而PLGA-pMS的多孔结构导致了明显的突释和较短的缓释时间,过快的药物释放不利新组织的形成。在组织工程领域,作为支架的载生长因子的PLGA-pMS尚未报道。本课题在前期研究的基础上进行优化,旨在改善PLGA-pMS的细胞亲和性,并使其具备缓释生长因子的能力。因此,本课题合成了GRGDSPC肽修饰的PLGA,并制备分别载BMP-2和TGF-β1的壳聚糖微球(CS-MS),再将载生长因子的CS-MS混入PLGA-pMS中,得到GRGDSPC肽修饰的镶嵌载生长因子CS-MS的PLGA多孔复合微球支架(CS-MS-PLGA-pMS)。通过GRGDSPC与细胞表面整合素受体的识别作用,改善PLGA-pMS的细胞亲和性,促进种子细胞在支架上的粘附,再通过缓释BMP-2和TGF-β1促进细胞的增殖和分化,以及骨组织的生成。首先,以CS-MS为研究对象,以合适的粒径和较高的包封率为目标,采用乳化离子交联法制备CS-MS,并对其形态、粒径、包封率和体外释放进行考察。通过单因素考察,对TPP浓度、壳聚糖浓度、壳聚糖分子量、交联反应时间和搅拌速度进行了分析,并进一步考察了TPP浓度和交联反应时间对模型药物白蛋白(BSA)的体外释放的影响,确定了最优的处方条件。以优选处方制得了分别载BMP-2和TGF-β1的CS-MS,粒径分别为15.47±0.53μm和14.78±0.71μm,载药量为每毫克CS-MS含有1004.27±15.30 ng BMP-2或332.46±44.88 ng TGF-β1,体外缓释时间均可达到9天。结合W1/O/W2溶剂挥发法和发泡法制备了本课题的可注射骨组织工程支架——PLGA-pMS。以PLGA-pMS为研究对象,以较大的表面孔径和合适的粒径为目标,进行单因素考察,分析了搅拌速度、PLGA浓度、均质速度、致孔剂浓度、PVA浓度和O/W1比例对微球形态、粒径和表面孔径的影响,并确定优选处方,得到了粒径为353.32±35.24μm,表面孔径为26.30±3.86μm的多孔微球。采用GRGDSPC对PLGA进行改性,先将GRGDSPC-SH与NH2-PEG-Mal连接,得到NH2-PEG-GRGDSPC,再与PLGA-NHS反应,合成目标产物PLGA-PEG-GRGDSPC. HPLC显示GRGDSPC和PEG具有极高的反应效率(90.60±2.20%)。采用1H-NMR鉴定合成产物后,依照优选处方,用PLGA-PEG-GRGDSPC制备PLGA-pMS,并考察MG-63细胞在多孔微球表面的粘附情况。结果表明,相比无修饰和PEG修饰的微球,MG-63细胞在GRGDSPC修饰的PLGA-pMS表面有更广泛的粘附和更高的细胞活性。GRGDSPC显著改善了PLGA-pMS的细胞亲和性,确定后续实验的PLGA-pMS均采用20%GRGDSPC修饰。在PLGA-pMS制备的初乳中混入CS-MS,得到镶嵌CS-MS的PLGA-pMS,采用激光共聚焦显微镜(CLSM)和扫描电子显微镜(SEM)对其进行了分析和鉴定。在多孔复合微球支架中,CS-MS被包埋在PLGA中,并保持了圆整的形态。载药量分别为每毫克多孔复合微球支架含有570.27±16.20 ng BMP-2或28.58±5.35 ng TGF-β1。在此基础上,研究了CS-MS-PLGA-pMS中BSA的体外释放,进而分别分析了BMP-2和TGF-β1的释放。相比CS-MS, CS-MS-PLGA-pMS中BMP-2和TGF-β1的首日突释减小,体外缓释时间显著延长,由9天增加至28天。采用密度梯度离心法和贴壁细胞删选法,分离和纯化了兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并进行传代培养,得到了骨组织修复所需的种子细胞。针对MSCs的多分化潜能和表面标志物对其进行分析和鉴定。结果发现,MSCs可在成骨诱导分化培养基中,大量表达具有成骨细胞特征的碱性磷酸酶；在成脂诱导分化培养基中,大量表达具有脂肪细胞特征的脂滴。流式细胞仪检测结果显示,细胞高表达CD90,低表达CD45,符合MSCs的表型特征。细胞分化实验和流式细胞术结果表明,培养的细胞为MSCs。将MSCs与PLGA-pMS共培养时,MSCs可粘附在多孔微球表面。与未修饰和PEG修饰的微球相比,MSCs在GRGDSPC修饰的PLGA-pMS表面有更广泛的分布和更高的细胞活性,表明GRGDSPC显著改善了PLGA-pMS的细胞亲和性。在得到种子细胞MSCs和载生长因子的多孔复合微球支架CS-MS-PLGA-pMS后,以新骨再生为目标,考察了裸鼠皮下异位成骨和家兔颅骨缺损修复这两个方面。载BMP-2的支架显著促进了异位骨的形成,其不仅具有更大的重量,而且在骨密度和骨体积等方面显著优于空白组和空白支架。组织切片的HE染色和Masson’s trichrome染色结果显示,BMP-2-CS-MS-PLGA-pMS形成的异位骨中,新骨分布广泛,并可观察到明显的骨小梁结构。空白组由于缺乏MSCs依附的载体,新骨生长状况和质量不佳。与空白组和空白支架相比,载TGF-β1的支架显著提高了异位骨的重量。在设计的用量和比例下,联用BMP-2和TGF-β1的支架促进了新骨的形成,与单用BMP-2相比,两者形成的异位骨的重量、骨密度和骨体积未显示统计学差异。组织学结果显示,联用BMP-2和TGF-β1的异位骨中有大量尚未完全钙化但可逐渐发展为成骨基质的类骨质。在家兔颅骨缺损修复实验中,在两侧顶骨成功制造了全骨缺损,并将微球支架植入缺损中,但手术部位的炎症反应,导致未取得理想的骨缺损修复效果。