鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白的制备及缓解关节炎活性研究

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肉鸽是广东代表性的禽类之一,年产近3亿只。作为肉鸽的副产物之一,鸽骨架通常被废弃,得不到充分利用,造成资源浪费。研究表明动物骨架可以作为提取胶原蛋白的原料,其中Ⅱ型胶原蛋白主要分布于关节软骨中,对类风湿性关节炎、软骨发育不良等疾病具有显著疗效。目前,对鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白提取工艺、结构表征及其功效研究尚未报道。因此,本文以鸽骨架为原料,优化鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白的提取工艺,解析其理化性质及结构,并探究其缓解类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的作用效果,以期为鸽骨架的综合利用及Ⅱ型胶原蛋白缓解类风湿性关节炎的应用提供理论指导。主要研究结果如下:(1)通过单因素试验及响应面分析得到鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白最佳提取工艺为:胃蛋白酶浓度1.25%,酶解温度20℃,酶解时间48h。在此条件下,Ⅱ型胶原蛋白提取率为24.92%。利用Na Cl对酶解液中的Ⅱ型胶原进行盐析,最佳的盐析工艺条件为:Na Cl浓度2mol/L,盐析温度18℃,盐析时间24 h。在此条件下,Ⅱ型胶原蛋白回收率为69.51%,Ⅱ型胶原蛋白粗提物纯度较高。(2)通过氨基酸自动分析仪测定鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白的氨基酸组成,其中甘氨酸、羟脯氨酸和丙氨酸含量最高,每1000个氨基酸残基中含量分别为258、84及89,没有检测出色氨酸,是典型的Ⅱ型胶原的氨基酸组成。SDS-PAGE结果表明鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白含有一条含量较高的α带和少量的β二聚体,二者的分子量分别为130和270k Da,符合典型的Ⅱ型胶原特性。圆二色谱和红外光谱测定结果表明该Ⅱ型胶原蛋白是由三条相同的α链构成的螺旋。Ⅱ型胶原蛋白的变性温度为40.61℃,在232 nm附近有紫外特征吸收峰,等电点为5.20,通过扫描电镜和原子力显微镜观察到该Ⅱ型胶原的表面为疏松网状结构,胶原纤维粗细均匀,互相缠结。由此可见,实验所用方法可得到典型的Ⅱ型胶原蛋白,鸽骨架可以作为Ⅱ型胶原蛋白的原料。(3)通过构建胶原诱导的类风湿关节炎(collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA)大鼠模型,研究鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白在动物体内预防类风湿性关节炎作用并进行分子机理研究,得到以下结论:鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白对大鼠胸腺指数、脾脏指数、肝脏指数、肾脏指数和心脏指数无显著影响(p>0.05),表明其没有毒性,对机体与免疫系统无显著副作用。鸽骨架Ⅱ型胶原高剂量组大鼠关节指数为4.20±0.45,而CIA模型组大鼠关节指数为6.33±0.58。同时鸽骨架Ⅱ型胶原组大鼠膝关节滑膜组织炎症程度与CIA模型组相比显著降低,表明鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白具有缓解类风湿性关节炎作用。进一步通过对大鼠血清中细胞因子的分析,结果表明鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白能够有效降低机体内IL-1β(p<0.05)、TNF-α(p<0.05)、IFN-γ(p<0.05)和Ig M(p<0.05)的水平,提高IL-10(p<0.05)的水平;通过实时荧光定量逆转录PCR对类风湿性关节炎炎症相关基因进行转录水平分析,结果显示,鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白能够有效抑制肝脏COX-2(p<0.05)、IL-1β(p<0.05)、TNF-α(p<0.05)和IFN-γ(p<0.05)等基因的转录表达,促进IL-10(p<0.05)的转录表达,表明鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白主要通过降低促炎因子的表达,提高抗炎因子的表达,从而实现缓解类风湿性关节炎的功效。上述研究表明,鸽骨架Ⅱ型胶原蛋白具有缓解类风湿性关节炎的潜在应用,为鸽骨架副产物的高值化利用开发提供依据。
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