论文部分内容阅读
目的:本课题组前期研究发现，增殖性糖尿病视网膜病变(proliferativediabetic retinopathy，PDR)患者玻璃体液中的富半胱氨酸蛋白61(Cysteine rich61，Cyr61)的含量明显升高，高糖培养条件能促进人Müller细胞中Cyr61的表达升高，并初步发现Cyr61对人Müller细胞有促凋亡作用。本研究通过体外培养人视网膜Müller细胞，观察高糖条件下不同浓度Cyr61对人Müller细胞的凋亡作用和对周期的影响，研究其凋亡信号通路相关蛋白和mRNA的表达并探讨其可能的凋亡发生机制。 方法:采用体外培养的人视网膜永生株Müller细胞系MIO-M1高糖(25mmol/L Glucose)模型，将浓度分别为0、10、30、100、300ng/mL的Cyr61分别加入Müller细胞中培养24h和48h，通过MTT比色法检测Cyr61对Müller细胞存活率的影响。通过流式细胞术，检测不同浓度Cyr61(0、30、300ng/mL)对Müller细胞周期的影响。将浓度分别为0、10、30、100、300ng/mL的Cyr61分别加入Müller细胞中培养24h，通过Caspase-3/7(cysteinyl aspartate specificproteinase-3)荧光光度分析法检测Cyr61对人Müller细胞凋亡的影响。将不同浓度(0、30、300ng/mL) Cyr61分别加入Müller细胞中培养24h，通过Westernblot技术检测不同浓度Cyr61培养下Müller细胞凋亡相关蛋白表达的变化，通过RT-qPCR（reverse transcription-quantitative PCR）技术检测Cyr61对Müller细胞凋亡相关蛋白在mRNA表达水平的影响。以上所有实验均重复三次(n=3)，结果用配对t检验(paired t-test)统计方法分析。 结果: 1.MTT结果显示:人视网膜Müller细胞在含不同浓度Cyr61(0、10、30、100、300ng/mL)的培养基中培养24h，通过MTT比色法测得的490nm的OD平均值分别为(0.79±0.05)、（0.77±0.04）、(0.68±0.09)、（0.60±0.05）、（0.57±0.04）。人Müller细胞存活率在Cyr61浓度为30ng/mL时开始下降，与对照组（0ng/mL Cyr61组）相比，差异有统计学意义(paired t-test，P=0.04)。随着Cyr61浓度增大，Müller细胞存活率逐渐降低。100ng/mL Cyr61组与对照组的差异达到极显著水平(paired t-test，P=0.006)。300ng/mL Cyr61组细胞存活率显著低于对照组，差异有统计学意义(paired t-test，P=0.0005)。培养48h时，通过MTT比色法测得的490nm的OD平均值分别为(1.11±0.10)、(0.96±0.04)、(0.95±0.10)、(0.75±0.05)、(0.69±0.05)。人Müller细胞存活率在Cyr61浓度为10ng/mL时开始下降，随着Cyr61浓度增大，Müller细胞存活率越低。Cyr61浓度为10、30、100ng/mL、300ng/mL分别与对照组（0ng/mL Cyr61组）相比，差异均有统计学意义（paired t-test，P值分别为0.02、0.01、0.0003、0.00004）。均呈剂量正相关。 2.流式细胞术结果显示:在不同浓度Cyr61(0、30、300ng/mL)培养Müller细胞24h时，细胞分裂G1期所占的百分比分别为:（78.67±0.09％）、（77.64±1.83％）、（76.14±2.81％）;细胞分裂G2期所占的百分比分别为:（9.70±0.05）％、（9.73±0.89％）、（10.19±1.15％）;细胞分裂S期所占的百分比分别为（11.63±0.14％）、（12.62±1.22％）、（13.68±1.71％）。差异均无统计学意义(paired t-test，P＞0.05)。 3.Caspase-3/7实验结果显示:Müller细胞在不同浓度Cyr61(0、10、30、100、300ng/mL)培养24h时，通过荧光定量法检测Caspase荧光强度值分别为(1695.22±508.55)、(2200.94±166.49)、(2441.86±296.66)、(2903.36±408.20)、（4491.4±291.03）。Caspase荧光值在Cyr61浓度为30ng/mL开始增加，随着Cyr61浓度的升高，Caspase荧光值逐渐增加。Cyr61浓度为30ng/mL、100ng/mL、300ng/mL分别与对照组（0ng/mL Cyr61组）相比，差异均有统计学意义(pairedt-test，P值分别为0.025、0.002、0.0001)。 4.Western blot实验结果显示:人Müller细胞在不同浓度Cyr61（0ng/mL、30ng/mL、300ng/mL）培养24h时，与对照组（0ng/mL Cyr61组）相比，AKT蛋白表达无明显变化(paired t-test，P＞0.05)。p-AKT蛋白和在Cyr61浓度为300ng/mL时，与对照组相比，表达下降(paired t-test，P=0.004)。而AKT通路下游蛋白Caspase-3，在Cyr61浓度为300ng/mL时表达升高(paired t-test，P=0.009)。 5.RT-qPCR结果显示:在不同浓度（0、30、300ng/mL）Cyr61培养人Müller细胞24h后，凋亡信号通路相关因子AKT、Caspase-3在mRNA水平均无明显变化(paired t-test, P＞0.05)。 结论: 1.Cyr61可以促进高糖培养下Müller细胞的凋亡，且呈剂量依赖模式。 2.Cyr61可能通过抑制AKT信号通路，导致Müller细胞凋亡。 3.Cyr61可能是在蛋白水平，而非mRNA水平影响凋亡相关因子的表达。