RNA干扰技术是目前新兴且日益成熟的的基因沉默技术,目前被认为是基因工程学领域的非常有效的研究工具。用此技术可以高效稳定特异地阻止目标基因的表达,从而达到较为理想的沉默效果。目前,dsRNA,特别是siRNA已被广泛而成功地应用于诸如基因功能研究以及疾病病因与治疗研究等多个领域。Survivin是耶鲁大学Ambrosini等于1997年发现的,是凋亡抑制蛋白家族新成员,具有分子量小、功能强大等特点。它是迄今发现的最强的凋亡抑制因子,主要分布于胚胎及分化未成熟的组织。在成人体内除胸腺及胎盘中有微量表达外,所有分化成熟的组织,包括外周血白细胞、淋巴结、脾、胰、肾、骨骼肌、心、肝、肺、脑组织中均无表达,而在人类肿瘤中几乎都表达。并且Survivin与肿瘤的侵袭性密切相关。本研究方法是:首先,检测Survivin在垂体腺瘤中的蛋白表达,探讨Survivin与垂体腺瘤侵袭性发生的相关性以及它们之间的内在联系。然后,通过设计在垂体瘤细胞中稳定高效表达的Survivin-siRNA质粒载体,研究该重组载体对于垂体瘤细胞中Survivin的干扰效果,并进一步明确干扰前后垂体瘤细胞的增殖及凋亡水平变化,以期探讨Survivin是否可成为未来进行垂体瘤基因治疗研究的有效靶点。第一部分Survivin在垂体瘤中的表达及与生物学行为关系目的Survivin是凋亡抑制蛋白家族非常独特的成员,其基因在肿瘤中的表达与增加肿瘤的侵袭性和降低患者的生存率关系密切。本研究目的是检测Survivin基因在垂体腺瘤中的蛋白表达,并探讨Survivin与垂体腺瘤侵袭性发生的相关性以及它们之间的内在联系。方法1.标本回顾性随机收集2006年7月-2008年4月期间山东省立医院神经外科的垂体腺瘤手术标本66例,其中女性29例(年龄29-77岁,平均年龄65.3±4.3岁),男性37例(年龄34-82岁,平均年龄68.1±2.5岁)。依据MRI提示肿瘤侵犯海绵窦或有骨质破坏,和/或术中观察肿瘤对周围骨质、海绵窦有/无侵犯等情况分为侵袭性组(39例)和非侵袭性组(27例)。所有病例诊断均有术后的免疫组化病理证实。2.免疫组化染色方法采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P)法,按标准实验流程,检测Survivin基因在侵袭性和非侵袭性垂体瘤中的蛋白表达。3.结果判定标准根据半定量免疫组织化学评价Survivin反应阳性细胞显色强度。在高倍视野(×400)下,每张切片随机观察5个视野的肿瘤细胞,计算200个肿瘤细胞免疫反应阳性的细胞百分比。每张切片分别有四名实验者进行单独评价,对于有分歧的进行重复评价,直至达到一致。Survivin表达评估:强阳性(+++):阳性细胞大于50%或显色深;中度阳性(++):阳性细胞10%至50%之间或染色略深;弱阳性(+):阳性细胞小于10%或显色浅;阴性(一):无阳性细胞染色。4.统计分析用卡方检验进行统计分析。SPSS(版本13.0)统计学软件进行统计。设定p＜0.05有统计学意义。结果Survivin在垂体瘤中以细胞质着色为主,仅有散在的细胞核着色。Survivin总的阳性率为69.7%(46/66)。在侵袭性垂体瘤中Survivin的阳性率为89.7%(35/39);而在非侵袭性垂体瘤中Survivin的阳性率仅为40.7%(11/27)。卡方检验示两组差异有统计学意义(x~2=14.309,P=0.0002＜0.05)。另外,在免疫组化反应为阳性的侵袭性垂体瘤中以强阳性和中度阳性为主(71.4%,25/35),而在非侵袭性垂体瘤中以弱阳性为主(72.7%,8/11)。结论1.Survivin在垂体瘤中有高表达。2.Survivin在侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤中的表达有显著性差异,因此Survivin与垂体瘤的侵袭性密切相关。3.Survivin可以作为判断垂体腺瘤侵袭性生长的有效指标和用做垂体瘤基因治疗研究的靶点。第二部分设计并筛选针对Survivin有效的siRNA载体目的设计并合成3组针对Survivin基因的siRNA质粒载体,并筛选出其中2组有效的载体,为下一步的研究做准备。方法1.设计并合成siRNA载体本实验运用公众网站设计软件,针对大鼠的Survivin靶基因序列,设计3组siRNA载体,分别标记为1#,2#,3g;同时合成1组为阴性对照载体,标记为0#。然后进行测序比对。结果显示四组载体被成功构建,测序无误。2.转染工具细胞株(胶质瘤C6)培养生长状态良好的工具细胞(胶质瘤C6),转染前一天将细胞分入6-孔培养板培养,转染当天按实验设计的分组情况加入不同质粒载体进行细胞的转染实验。转染48小时后荧光显微镜下观察GFP表达情况,观测转染效率。3.检测干扰效果,筛选有效载体。选出转染效率为90%左右的组,采用FQ-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果,筛选出2组有效载体。结果1.在3组siRNA载体中,1#、2#、3#转染效率分别为87.4±6.2%、92.6±4.5%、75.3±11.0%;阴性对照载体0#的转染效率为95.0±4.2%。2.3个靶点均有敲减效果。与阴性对照载体0#对比,载体1#,2#,3#敲减效率分别为68.4%、44.4%、22.7%。综合转染效率及敲减效果,1#、2#是最佳的靶点。结论1.本部分实验成功构建了3组特异性针对大鼠基因Survivin的siRNA载体。2.通过该部分实验,我们成功地从3组重组载体中筛选出高效率的靶点,为下一步选用高效率的重组载体对垂体瘤细胞GH3进行转染提供了可靠的实验基础。第三部分RNAi沉默Survivin基因对垂体瘤细胞增殖及凋亡水平的影响目的利用构建好的特异性强、转染率高的携带针对Survivin的siRNA载体1#、2#,研究它们介导RNA干扰对垂体瘤细胞株GH3增殖和凋亡的影响及其意义。方法1.分别利用siRNA载体1#、2#转染垂体瘤细胞株(GH3细胞)培养生长状态良好的目的细胞(即GH3细胞),转染前一天将目的细胞分入6-孔培养板培养,转染当天按实验设计的组别分别利用siRNA载体1#、2#和对照载体0#进行垂体瘤细胞的转染实验。2.用G418筛选出稳定的转染细胞株将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100μg/ml-1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10-14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3-5天都要更换一次含有G418的筛选液。荧光显微镜下观察GFP表达情况,14天后,即可筛选出稳定转染的细胞株。3.测定基因沉默效果分别采用FQ-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况和用Western-blot方法检测Survivin蛋白表达,测定基因沉默效果。4.MTT检测细胞增殖水平培养生长状态良好且已稳定转染垂体瘤细胞(GH3细胞)。按实验设计的分组(空白对照组,阴性对照组以及阳性组)情况,将细胞分入96-孔培养板培养。第2天后进行MTT分析,检测对RNAi靶点有效干扰后的垂体瘤细胞增殖水平变化。5.PI染色流式细胞技术检测GH3细胞的细胞凋亡培养生长状态良好且已稳定转染垂体瘤细胞(GH3细胞)。按实验设计的分组(空白对照组,阴性对照组以及阳性组)情况,进行PI染色流式细胞仪分析,检测对RNAi靶点有效干扰后的垂体瘤细胞周期及凋亡的变化。结果1.FQ-PCR结果显示,siRNA载体1#、2#对GH3细胞中Survivin基因的表达有显著敲减作用。它们的敲减效率分别为54.4%和54.0%。Western-blot结果显示了类似的结果。2.MTT检测细胞增殖水平实验结果表明,实验组1#,2#的增殖抑制率(IR)分别为42.5%和38.7%,与阴性对照组和空白对照组相比差异有显著性(P＜0.05),这一结果提示在Survivin被沉默后,垂体瘤细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长能力明显被抑制。3.通过PI染色流式细胞方法检测细胞群体中各时期细胞的比例,我们发现,两个siRNA载体组与对照组比较,在Survivin被沉默以后,垂体瘤细胞群体中,凋亡细胞增加(P＜0.05)。结论1.Survivin基因对于垂体瘤细胞的生长和增殖能力具有重要作用;特异性沉默Survivin基因能引起大鼠垂体瘤细胞生长周期迟缓,诱发垂体瘤细胞凋亡。2.RNA干扰技术在未来的垂体瘤基因治疗的研究方面具有应用价值。Survivin基因有望成为垂体瘤基因治疗的有效靶点。