目的肿瘤标志物(tumor marker, TM),是指在肿瘤发生和增殖过程中,由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、体液中,反映肿瘤存在和生长的一类物质。肿瘤标志物可以分成以下几大类：①肿瘤胚胎性抗原；②酶和同工酶；③血浆蛋白；④细胞代谢产物；⑤肿瘤抗原；⑥癌基因和抑癌基因蛋白产物及微量元素。肿瘤抗原(tumor antigen)泛指在肿瘤发生、发展过程中新出现或者过度表达的一些抗原物质。免疫应答过程有赖于免疫系统中细胞间的相互作用,一种是通过细胞间的直接接触,另一种是通过分泌细胞因子或其他活性分子而介导的相互作用。细胞表面功能分子是免疫细胞之间相互识别的物质基础,包括细胞表面的多种抗原、受体和其他分子。应用单克隆抗体鉴定为主的方法,将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原决定簇,统称为CD (cluster of differentiation)。些研究者研究发现,正常细胞和肿瘤细胞所表达的CD抗原不同,并且CD与肿瘤的发生发展有着密不可分的联系。本课题研究制备的细胞芯片就是用来高通量检测细胞表面CD抗原的表达情况。将六十四种CD抗原单克隆抗体固定于载体上,首先形成抗体点阵,随后利用抗原、抗体特异性结合的原理,不同的单克隆抗体能够自动识别和捕获表达相应表面分化抗原的细胞,从而检测多种肿瘤细胞表面相应CD表型的表达情况。细胞芯片技术可快速地分析正常与癌细胞表面CD抗原表型的差异,不仅有助于肿瘤发病机制的阐明,还能筛选肿瘤细胞CD抗原表型标志物,在肿瘤的发生机制研究、诊断和治疗方面,具有广阔的应用前景。方法1、细胞培养培养9种细胞备用,人正常胃粘膜细胞系GES-1、人胃腺癌细胞系7901、人正常肝上皮细胞系L-02、人肝癌细胞系Bel7404、人胰腺癌细胞系PANC-1、人小细胞肺癌细胞系H446、人大细胞肺癌细胞系H460、人肺腺癌细胞系A549和人大肠癌细胞系HT29；2、应用细胞芯片捕获肿瘤细胞并检测其细胞表面CD抗原表型的表达；3、验证细胞芯片检测肿瘤细胞表面CD抗原表型表达的特异性；(1)应用RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)方法验证细胞芯片对人正常胃粘膜细胞系GES-1、人胃腺癌细胞系7901和人胰腺癌细胞系PANC-1细胞表面CD抗原表型的检测结果；(2)基因测序验证人正常胃粘膜细胞系GES-1、人胃腺癌细胞系7901细胞表面CD抗原表型表达的RT-PCR扩增结果；(3)应用流式细胞术验证细胞芯片捕获细胞的特异性；4、细胞芯片阳性点荧光标记CD的筛选。结果1、细胞芯片上CD13、CD29、CD49e、CD55、CD44、CD71、CD95、CD133抗体点捕获到人小细胞肺癌细胞系H446细胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD133、CD95抗体点捕获到人大细胞肺癌细胞系H460细胞；CD29、CD44、CD49e、CD55、CD61、CD71、CD133、CD90抗体点捕获到人肺腺癌细胞系A549细胞；CD9、CD15、CD24、CD29、CD44、CD55、CD66、CD31抗体点捕获到人大肠癌细胞系HT29细胞；CD13、CD29、CD44、CD55、CD71抗体点捕获到人胰腺癌细胞系PANC-1细胞；CD9、CD13、CD15、CD29、CD49e、CD44、CD55、CD71、CD77抗体点捕获到人肝癌细胞系Bel7404细胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD56、CD57、CD71抗体点捕获到人正常肝上皮细胞系L-02细胞；CD9、CD13、CD15、CD24、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95抗体点捕获到人正常胃粘膜细胞系GES-1细胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95、CD77、CD133、CD103、CD64抗体点捕获到人胃腺癌细胞系7901细胞。2、RT-PCR检测人胃腺癌细胞系7901和人正常胃粘膜细胞系GES-1 CD表型mRNA的表达,结果显示7901和GES-1均有CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95的表达,与我们的细胞芯片检测CD表型的结果相一致；RT-PCR检测人胰腺癌细胞系PANC-1 CD表型：nRNA的表达,结果显示CD71、CD55均有表达,与我们的细胞芯片检测CD表型的结果相一致。3、应用流式细胞术的方法,检测人胃癌细胞系7901与人胃正常细胞系GES-1细胞表面CD15、CD24、CD44的表达,流式结果显示与我们的细胞芯片检测CD表型的结果相一致。4、从FITC-CD14、FITC-CD4、PE-CD3、FITC-CD19、PE-Cy5-CD19、FITC-Cy5-CD2、FITC-CD3、Cy-Chrome-CD22和PE-CD14等9种荧光标记的CD中,筛选最佳细胞芯片阳性标点,结果发现PE-CD13效果最好。结论1、细胞芯片CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD133抗体点均捕获人小细胞肺癌细胞系H446细胞、人大细胞肺癌细胞系H460细胞和人肺腺癌细胞系A549细胞；CD13、CD95抗体点捕获到人小细胞肺癌细胞系H446细胞和人大细胞肺癌细胞系H460细胞,未捕获到人肺腺癌细胞系A549细胞；CD9抗体点仅捕获到人大细胞肺癌细胞系H460细胞,未捕获到人小细胞肺癌细胞系H446细胞和人肺腺癌细胞系A549细胞；CD61、CD90抗体点仅捕获到人肺腺癌细胞系A549细胞,未捕获到人小细胞肺癌细胞系H446细胞和人大细胞肺癌细胞系H460细胞。2.、细胞芯片CD29、CD44、CD55、CD71抗体点均捕获到消化系肿瘤细胞系细胞,人大肠癌细胞系HT29细胞、人胰腺癌细胞系PANC-1细胞、人胃腺癌细胞系7901细胞和人肝癌细胞系Bel7404细胞；CD9抗体点捕获到人大肠癌细胞系HT29细胞、人胃腺癌细胞系7901细胞和人肝癌细胞系Bel7404细胞,未捕获到人胰腺癌细胞系PANC-1细胞；CD13抗体点捕获到人胰腺癌细胞系PANC-1细胞、人胃腺癌细胞系7901细胞和人肝癌细胞系Bel7404细胞,未捕获到人大肠癌细胞系HT29细胞；CD15抗体点捕获到人大肠癌细胞系HT29细胞和人肝癌细胞系Bel7404细胞,未捕获到人胰腺癌细胞系PANC-1细胞和人胃腺癌细胞系7901细胞；CD49e、CD77抗体点捕获到人胃腺癌细胞系7901细胞和人肝癌细胞系Bel7404细胞,未捕获到人大肠癌细胞系HT29细胞和人胰腺癌细胞系PANC-1细胞；CD24、CD66、抗体点仅捕获到人大肠癌细胞系HT29细胞；CD95、CD133、CD103、CD64抗体点仅捕获到人胃腺癌细胞系7901细胞。3.、细胞芯片CD29、CD44、CD55、CD71抗体点均捕获到人小细胞肺癌细胞系H446细胞、人大细胞肺癌细胞系H460细胞、人肺腺癌细胞系A549细胞、人大肠癌细胞系HT29细胞、人胰腺癌细胞系PANC-1细胞、人胃腺癌细胞系7901细胞和人肝癌细胞系Be17404细胞。4、细胞芯片CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71抗体点捕获到人肝癌细胞系Be17404细胞和人正常肝上皮细胞系L-02细胞；CD15、CD77抗体点仅捕获到人肝癌细胞系Be17404细胞,未捕获到人肝上皮细胞系L-02细胞；CD56、CD57抗体点仅捕获到人正常肝上皮细胞系L-02细胞,未捕获到人肝癌细胞系Bel7404细胞。5、细胞芯片CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95抗体点均捕获到人正常胃粘膜细胞系GES-1细胞和人胃腺癌细胞系7901细胞；CD15、CD24抗体点仅捕获到人正常胃粘膜细胞系GES-1细胞,未捕获到人胃腺癌细胞系7901细胞；CD77、CD133、CD103、CD64抗体点仅捕获到人胃腺癌细胞系7901细胞,未捕获到人正常胃粘膜细胞系GES-1细胞；CD15和CD24可能是人正常胃粘膜细胞系GES-1细胞的表面标志物,CD77、CD133、CD103、CD64可能是人胃癌细胞系7901细胞的标志物。6、RT-PCR检测人胃腺癌细胞系7901和人正常胃粘膜细胞系GES-1 CD表型mRNA的表达,结果显示7901和GES-1均有CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD77、CD95 mRNA的表达,与我们的细胞芯片检测CD表型的结果相一致；RT-PCR检测人胰腺癌细胞系PANC-1 CD表型mRNA的表达,结果显示CD71、CD55均有表达,与我们的细胞芯片检测CD表型的结果相一致。7、应用流式细胞术的方法,检测人胃腺癌细胞系7901与人胃正常细胞系GES-1细胞表面表达CD15、CD24、CD44,结果显示,人胃腺癌细胞系7901细胞表面不表达CD15、CD24,表达CD44；人胃正常细胞系GES-1细胞表面表达CD15、CD24、CD44,与我们的细胞芯片检测CD表型的结果相一致。8、确定最佳细胞芯片阳性标点试剂是PE-CD13。