【摘 要】
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猪圆环病毒（Porcine circovirus type,PCV）无包膜结构,是极小的ss DNA病毒。截至目前,共发现四种猪圆环病毒亚型,即PCV1-PCV4。通常认为PCV1不致病,而PCV2是致病的;PCV3和PCV4有一定致病性,但需要大量数据或研究进行证实。PCV1-PCV4结构相似,基因组都包含两个主要的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,ORF1编码复制相关
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猪圆环病毒（Porcine circovirus type,PCV）无包膜结构,是极小的ss DNA病毒。截至目前,共发现四种猪圆环病毒亚型,即PCV1-PCV4。通常认为PCV1不致病,而PCV2是致病的;PCV3和PCV4有一定致病性,但需要大量数据或研究进行证实。PCV1-PCV4结构相似,基因组都包含两个主要的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,ORF1编码复制相关的Rep蛋白,ORF2编码Cap蛋白。Cap蛋白是病毒主要抗原蛋白,其上有病毒主要的抗原决定簇,相较于Rep蛋白具有更强的免疫原性,并且在病毒传播和侵染过程中起重要作用。据研究报道,PCV1-PCV3在世界范围内广泛存在,PCV4也在中国、韩国等地被发现,但是PCV4局限于发现时间较短而没有足够的研究数据。作为免疫抑制病毒,PCV2/PCV3/PCV4（PCVs）更可怕的是可以与其他病毒、细菌等共感染导致全球猪群的巨大损失。虽然目前PCV2已有几种基于VLPs的疫苗面世并且可以显著降低病毒感染及病毒导致的病变,但是更为严峻的是PCV3与PCV4的疫苗还未商用,此外PCV3已在全球范围广泛的传播,且目前只能够通过药物控制。全球养猪业始终面临着巨大挑战,所以针对PCVs的疫苗研发与抗体开发对于控制PCVs传播与感染十分重要。本研究目的是制备抗PCV2/PCV3/PCV4-Cap蛋白（Caps）抗体,构建PCVs ORF2去除部分核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）的原核表达质粒,IPTG诱导表达条件优化实现了Caps高效表达,并利用亲和层析方式纯化获取重组Caps。为获得通用抗体,实验选择了相较小鼠具有更为广泛的抗体谱系且能够更好识别小分子抗原等优势的兔子作为免疫动物。使用未组装成病毒样颗粒（Virus like particles,VLPs）的线性Caps免疫兔子,规避表位可能存在于VLPs内部从而逃避免疫的问题。免疫后获得高免血清,并且验证发现三种抗血清之间存在着交叉保护反应。通过改变IPTG诱导条件,实现了Caps高效的可溶性表达并且Caps自组装形成VLPs;将Caps VLPs等量混合后免疫兔子获得了可同时抗Caps的三价抗体;通过免疫母鸡在蛋黄中提取出卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,Ig Y）,并利用琼脂扩散评估获得的Ig Y具有高效价。Ig Y与Ig G存在着结构和抗原上存在差异,并且由于产量高、易获取、高亲和力等优点可成为研究诊断PCVs的有力工具。综上所述,本研究通过原核表达得到重组Caps,利用亲和层析对重组蛋白进行纯化。线性Caps免疫兔子获得了高免抗血清,并且三种血清之间存在交叉保护反应,验证了通用抗体的存在。VLPs免疫兔子与海兰褐蛋鸡从而制备出三价抗血清与卵黄抗体,利用i ELISA,双向琼脂扩散,WB,IFA等实验验证了抗体具有高效价、高特异性、高亲和力的特点,也证实了研究中所得的VLPs具有作为疫苗使用的潜力。
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