三嗪类除草剂扑草净快速免疫检测方法的研究

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本论文对三嗪类除草剂扑草净的快速免疫检测方法进行了深入、系统的研究。建立了简便、快速、实用的扑草净免疫检测方法——直接竞争酶联免疫检测方法(dc-ELISA)和胶体金免疫层析试纸条检测方法(CGIA).通过合成扑草净半抗原,利用活化酯法连接载体蛋白(BSA)作为免疫原,制备出高效价、高特异性的多克隆抗体。对ELISA方法的工作条件(抗体包被量,酶标抗原稀释度,封闭液种类和浓度等)进行优化,对影响实验的各因素(离子强度,pH值等)进行了研究,最终确定方法的最佳工作条件为:抗体包被量为0.25μg/孔,酶标抗原的稀释度为1:50000,封闭液为0.5%乳粉,样品稀释液为1×PBS, pH=7.4。在此条件下建立ELISA方法的灵敏度(IC50)为0.3±0.03ng/mL,最低检出限(IC15)为0.04+0.006ng/mL。抗体对扑灭津和扑灭通的交叉反应率分别为71.4%和50%,对其他几种结构类似的三嗪类除草剂的交叉反应率较低。在对实际样品进行检测的研究中,选择海河水、土壤、和大米作为研究对象考查了它们的基质影响及其去除方法,并进行添加回收实验。直接竞争酶联免疫检测方法的回收率在80-120%。海河水、土壤、大米中扑草净的检出限分别为0.4ng/mL、0.8μg/kg和0.8μg/kg。采用柠檬酸三钠还原法制备出粒径为17.4nm的胶体金粒子,对CGIA方法的工作条件(包被抗原、羊抗兔二抗和金标抗体的稀释倍数、NC膜的封闭条件、金标垫处理液的种类等)进行优化。最终确定方法最佳工作条件为:包被原稀释倍数为1:15,羊抗兔二抗稀释倍数为1:300,金标抗体的稀释倍数为1:10,NC膜不做封闭,金标垫用10%蔗糖、5%BSA、0.1%吐温、0.1%叠氮钠处理。建立的方法检出限为5ng/mL,5min内可以通过目测进行结果判断。海河水不需要任何处理可以直接进行检测,检出限为5ng/mL通过高效液相色谱法对本研究建立的方法进行准确性验证,ELISA方法和HPLC方法的相关性较高,R2=0.986。CGIA方法和HPLC方法也有较好一致性。证明本研究建立的快速免疫检测方法具有很好的准确性和可靠性,可应用于环境和食品中扑草净残留的快速检测。
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