脑血管病是目前继心血管疾病,肿瘤之后的全球第三大致死疾病。其中缺血性中风的发病率及致死致残率更是居高不下。本项目组认为,中风病属于“络病”的范畴,“毒损脑络”是其核心病机。依据从络论治的原则治疗缺血性中风临床上也取得了不错的疗效。通络救脑注射液正是基于从络论治的原则,由栀子苷和三七总皂苷配伍而成的中药新药。基于此,本课题旨在研究在实验性大脑局灶性缺血再灌注损伤中,通络救脑注射液的脑保护作用是否与IGF-1能建立起关联,并进一步观察IGF-1是否对神经元具有可靠的保护作用,如有,又是通过何种信号传导途径发挥作用的。目的：观察通络救脑注射液对实验性大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及探讨其发挥保护作用的可能途径。首先确立胰岛素样生长因子1及其受体在实验动物脑组织的表达特点及通络救脑注射液的干预作用,两者间建立起关联；离体实验进一步观察IGF-1对神经元的保护作用,并探讨其发挥保护作用的信号转导途径。为“毒损脑络”及“从络论治”的中医理论提供现代分子生物学基础。方法：1.利用TTC染色、神经功能评分、HE染色、及免疫荧光等方法,观察造模后大脑梗死体积、神经行为学评分、脑组织的病理结构变化及神经元的改变,确证通络救脑注射液的干预作用。2.利用酶联免疫的方法观察大鼠血清IGF-1表达的组间差异；利用酶联免疫、免疫组化、蛋白免疫印迹的方法,检测通络救脑注射液对脑缺血再灌注损伤后患侧大脑IGF-1及IGF-1R表达的干预效应。3.原代培养大鼠皮层神经元,制备神经元氧糖剥夺模型,施加纯化的IGF-1单体,观察IGF-1对正常及氧糖剥夺神经元的作用,同时施加PI-3K及MAPK信号通路的阻断剂,通过MTT方法判断IGF-1的神经保护作用途径；利用蛋白免疫印迹法观察信号通路上关键蛋白磷酸化Akt的表达情况印证MTT的结果。4.以Western Blotting去通过观测通络救脑注射液干预前后磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路上两个重要的靶蛋白p-Akt和p-p44/42MAPK的表达变化,来观察这两条通路的激活情况,进而反推可能激活某条通路的干预因子。结果：1.比较通络救脑注射液对实验动物神经行为学干预的结果发现：以各组取材前与造模后神经功能评分变化值的差异作为参考指标,通络救脑组的各评分差值相对于各时间点的模型组都有显著的差异,阳性药物依达拉奉组在7天时与模型组的差异值差异显著。模型组、通络救脑组及依达拉奉组各组均有程度不等的梗死灶出现。相对于各时间点的模型组动物,通络救脑组动物的脑梗死体积比均有显著减小；对阳性药物组,缺血24小时的保护作用显著,其余时间点脑梗死体积比也比相应的模型组低,但未达到统计学差异。各假手术组大鼠大脑皮层及海马区神经元排布整齐,神经纤维形态密集、完整,MAP-2荧光强度高。各模型组及通络救脑组健侧的皮层及海马区神经元分布与假手术组无显著差异。各模型组患侧皮层MAP-2的表达明显减少,尤以梗死区为甚,可见较大范围的荧光暗区；相对于模型组,通络救脑组患侧皮层的MAP-2荧光表达强度有所增加,神经纤维形态相对完整。而对于海马区,我们发现模型组MAP-2的表达受造模的影响较小,海马区结构尚较完整,荧光强度与健侧相比未出现类似皮层表达的明显差异；通络救脑组类似,海马区MAP-2的表达受影响不大。2.血清IGF-1水平的ELISA结果显示,三个时间点的假手术组血清IGF-1水平无明显差异,缺血24小时的模型组大鼠血清IGF-1水平明显降低,缺血3天通络救脑组则显著升高；在模型组中,缺血7天组的动物血清IGF-1含量有显著升高；在通络救脑组,缺血3天的给药组动物的血清IGF-1水平均显著高于其余两组；观察各时间点各组动物患侧脑匀浆中IGF-1水平发现,相对于假手术组,模型3天组和通络救脑3天组的动物IGF-1的含量显著升高；在所有模型组动物中,缺血3天组的动物脑匀浆IGF-1水平要显著高于其余两个时间点的动物。与模型组相似,在通络救脑组,3天组的IGF-1水平亦要显著高于其余两组；患侧脑部切片的免疫组化结果提示3个时间点的假手术组动物皮层脑组织IGF-1的阳性表达面积百分比没有明显差异；相对于假手术组,缺血24小时及缺血3天的模型组动物IGF-1表达阳性面积均有显著升高,而缺血7天组的动物IGF-1表达则与假手术组没有显著差异；各个时间点的通络救脑组IGF-1的阳性表达面积百分比则均显著高于同时间点的各假手术组及模型组。3.患侧皮层IGF-1R的免疫组化结果显示,三个时间点的假手术组IGF-1R的阳性表达面积百分比之间没有显著的差异；相对于假手术组,造模24小时的通络救脑组的IGF-1R阳性表达面积有显著的升高;同样,该组的IGF-1R表达水平亦显著高于同时间点的模型组。对3天和7天组的比较中发现,模型组和通络救脑组及假手术组之间的IGF-1R表达水平没有显著差异,通络救脑组的表达水平均值稍高于模型组,但未达到统计学差异。通过蛋白免疫印迹的实验方法检测I-R大鼠缺血侧脑组织IGF-1R蛋白的表达,结果与免疫组化类似。4.生理情况下,施加IGF-1组的细胞活性较正常对照组显著升高,说明了IGF-1能有效促进神经元存活；在氧糖剥夺组在加入了IGF-1以后,神经元活性较单纯氧糖剥夺组有了明显的提升,这说明IGF-1对缺血缺氧神经元有确切的保护作用；而在加用了PI-3K通路的特异性阻断剂LY294002后,IGF-1的神经保护作用被显著抑制；反之加入MAPK通路的特异性阻断剂PD98059后,IGF-1发挥促神经元存活的作用未被PD98059阻滞,仍得以发挥。以正常对照组细胞表达的p-Akt水平作为基线对照,加入了IGF-1作用以后,p-Akt水平有明显的提高；神经元经历氧糖剥夺造模后,p-Akt水平明显降低；当加入IGF-1刺激后,p-Akt水平有一个飙升,而当同时加入阻断剂LY294002以后,p-Akt水平有了明显回落,表达微弱；以上结果显示IGF-1通过激活PI-3K通路而实现抗凋亡,促进细胞存活的作用。5.在观察所有组别动物患侧脑匀浆中p-Akt和p-p44/42MAPK的表达变化时发现,在造模3天时,模型组动物p-Akt和p-p44/42MAPK的表达水平较假手术组下降幅度较大,而通络救脑组的表达水平相对模型组有部分提升。结论：1.通络救脑注射液对脑缺血再灌注损伤保护作用明确,能有效减轻脑梗死体积,改善神经功能,保留更多的存活神经元,此作用可能与其能显著提高缺血侧大脑局部皮层IGF-1的表达有关,并且IGF-1R的表达在缺血后的特定时间点也能有明显的上调。2.IGF-1是重要的神经生长营养因子,其对生理情况及缺血缺氧病理情况下的神经元均具有明确的促进存活,增加活性的作用,这种作用是通过激活了PI-3K信号通路,进而启动了下游信号通路而实现的。3.通络救脑注射液干预后,可以激活PJ-3K和MAPK信号通路,这种作用在造模3天时达到了最活跃。因此,能在脑内表达(或能有效通过血脑屏障),并且能激活PI-3K和(或)MAPK信号通路的因子,可以列为能被通络救脑注射液干预后上调表达的假设因子之列,以备后续的实验进一步研究。