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氨萘非特(amonafide)是一个具有良好抗肿瘤活性的萘酰亚胺类化合物，美国国立癌症中心(National Cancer Institute)对其抗肿瘤能力进行了评价，证实它对多种肿瘤模型有效。临床研究显示，氨萘非特进入人体，被N-乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase2，NAT2)乙酰化，产生具有相当毒性的N-乙酰氨萘非特；N-乙酰基转移酶2分为快代谢型和慢代谢型，导致N-乙酰氨萘非特在不同的人体中蓄积量的差异很大，造成不可预知的毒副作用，使氨萘非特的临床研究受到影响。目前，Xanthus制药公司(Cambridge，Massachusetts，USA)采用联合用药等方法，对氨萘非特进行临床II期研究，试图找到合理应用该药的方式。
华东理工大学钱旭红教授课题组以氨萘非特为母核，对其进行结构改造，合成萘酰亚胺新衍生物，其中包括本课题研究的R16。R16同系列的化合物(包括R7、R9和R16等)对氨萘非特的5-氨基(5-NH2)位点进行杂环取代，避免被N-乙酰基转移酶2乙酰化，因而克服了氨萘非特的缺点。在这一系列化合物中，R16的体内抗肿瘤能力和溶解性等方面最为突出，而且其结构改造避免了潜在的乙酰基代谢物，并保留了氨萘非特良好的抗肿瘤活性，为相关化学结构的改造和修饰提供了成功的经验。本课题对R16开展系统的研究，证明该化合物具有明显的体内外抗肿瘤活性，并深入探讨其作用靶点和分子机制。
首先，采用磺基罗丹明B蛋白染色法检测R16对22株肿瘤细胞株的体外增殖抑制作用。结果显示R16对各种组织来源的人肿瘤细胞株均具有明显的生长抑制作用(平均IC50为3.47μM)，略强于氨萘非特(平均IC50为6.05μM)。同时，通过检测R16对三株多药耐药细胞株(K562/A02、KB/VCR和MCF-7/ADR)的增殖抑制作用，考察其抗多药耐药能力。R16和氨萘非特能显著抑制这三株多药耐药细胞的生长，平均耐药因子(RF)均为1.63，显著低于VP16(127.72)、ADR(106.94)和VCR(197.39)。此外，本文作者用小鼠S-180肉瘤和H22肝癌作为模型对R16体内抗肿瘤的活性进行评价，结果显示R16拥有与氨萘非特相当，甚至比其更强的抑制小鼠肿瘤生长的能力。
其次，对R16的抗肿瘤作用靶点进行研究。有报道利用无细胞体系在分子水平证明氨萘非特是一个拓扑异构酶II抑制剂，但是缺乏更为充分和系统的证据。因此，本课题对R16靶向Topo II的能力进行了深入研究，并详细探讨其后续生物学效应以及靶效关系。在分子体系，分别采用kDNA去连环实验和表面等离子共振(SPR)技术，证明R16不仅能够特异性抑制Topo II的活性，还能够直接结合于Topo II的ATPase区域。而TARDIS实验(Trapped in Agarose DNAImmuno Staining assay)则显示在细胞水平，R16能够捕获并稳定Topo II可切割复合物，明确其作用方式为Topo II毒剂。大多数Topo II毒剂拥有造成DNA双链断裂、引起细胞周期阻滞以及诱导凋亡的能力。因此本文作者检测了R16的这些能力，进一步确证其靶点，并阐明靶效关系。R16能够明显地引起DNA双链断裂(DNA DSBs)，使细胞周期阻滞在G2/M期，进而诱导细胞发生死亡受体途径和线粒体途径依赖的凋亡。ATM/ATR抑制剂咖啡因(caffeine)显著逆转R16诱导的细胞周期阻滞以及凋亡，证实作为DNA DSBs的主要感受器，ATM/ATR参与的信号途径是R16诱导周期阻滞和细胞凋亡的重要通路。Topo II催化抑制剂阿克拉霉素(aclarubicin，ACL)则不但能够拮抗R16诱导DNA DSBs的作用，也能对抗其造成的细胞凋亡。随后应用HL-60和HL-60/MX2( Topo II低表达)细胞模型，比较分析R16对这两株细胞的作用差异。在相同的实验条件下，R16在HL-60/MX2细胞中产生的DNA DSBs、细胞凋亡和细胞毒都明显弱于在亲本株HL-60细胞中的作用。这些结果提供了充分的证据，说明R16捕获的Topo II可切割复合物是其诱导DNA DSBs和细胞凋亡的前提条件，因此Topo II是R16的最重要靶点(primary target)，也是其发挥抗肿瘤作用的主要原因。本研究首次系统深入地阐述并确证萘酰亚胺类化合物在肿瘤细胞中的靶标，为此类化合物今后的开发提供了详细的研究资料和坚实的理论基础。
细胞周期阻滞是R16的另一个明显的生物学效应，也是其发挥抑制肿瘤细胞生长作用的重要因素之一。本文作者对R16和氨萘非特引起细胞周期阻滞的分子机制进行了深入的探讨，并将它们和一些经典的Topo II毒剂如依托泊甙(VP16)和阿霉素(ADR)等进行了比较。R16和氨萘非特能够明显诱导肿瘤细胞发生剂量和时间依赖性的G2期阻滞。利用caffeine以及RNA干扰技术，发现DNADSBs激活的ATM-ChK2通路介导的周期素B1(cyclinB1)在细胞内定位的变化是R16引起G2期阻滞的主要原因，而ATR则对R16、氨萘非特乃至其他TopoII毒剂引起的G2期阻滞贡献甚少。另外，R16和氨萘非特引起ChK1依赖泛素-蛋白酶体途径发生降解，从而导致ChK1磷酸化的瞬时性，不同于VP16和ADR对ChK1的持续激活，部分解释了与VP16和ADR相比，R16和氨萘非特诱导G2期阻滞对ChK1依赖较少的现象。本研究首次报道萘酰亚胺类化合物引起细胞周期阻滞的分子机理，并且发现此类化合物激活ChK1的方式与经典的Topo II毒剂VP16和ADR显著不同，为Topo II毒剂激活DNA损伤应答和周期检查点系统的研究增加了新的内容，提供了新的研究线索。
综上所述，本研究发现萘酰亚胺类新化合物R16具有较强的体内外抗肿瘤活性，对多株耐药细胞株表现出明显的生长抑制作用。机理研究表明R16是TopoII毒剂，通过捕获Topo II可切割复合物，引起DNA DSBs，从而诱导肿瘤细胞依赖死亡受体和线粒体两条途径发生凋亡，而DNA双链断裂激活的ATM-ChK2通路是R16诱导细胞G2期阻滞的主要途径。R16优于母体化合物氨萘非特的抗肿瘤活性以及Topo II靶向作用，加之对氨萘非特毒性代谢物的避免，使其成为一个很有希望的抗肿瘤候选化合物，值得进一步的研究和开发，而本文作者对其系统详细的抗肿瘤机制研究为同类化合物的设计和开发提供了有用的实验依据。