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胰岛素抵抗作为2型糖尿病的主要病理生理基础,在2型糖尿病的发生发展中起着重要作用。越来越多的科学研究表明氧化应激产生的活性氧作为一种信号分子,能够激活细胞内一系列应激信号分子,阻断胰岛素作用通路,成为导致胰岛素抵抗的重要原因之一。肾上腺髓质素(AM)是一种具有抗氧化能力的活性肽,AM基因缺失的小鼠出现全身特别是骨骼肌组织中氧化应激的增加并能够导致胰岛素抵抗,其机制可能与骨骼肌中葡萄糖转运体4(GLUT4)的转位或者数量以及活性改变有关。1-磷酸鞘氨醇(S1P)作为一种脂质信号分子,能够在细胞核内与组蛋白去乙酰基酶1(HDAC1)结合并抑制其活性,从而改变细胞核内组蛋白的乙酰基化水平来调节基因转录。目的①研究GLUT4在氧化应激诱导的胰岛素抵抗中发挥的作用;②明确在氧化应激状态下S1P调节GLUT4基因转录的机理。方法选择AM+/-雄性小鼠和C57BL/6雄性小鼠,分别给予普通饮食、高脂饮食以及高脂饮食与抗氧化剂TEMPOL联合喂养。普通饮食的两组小鼠作为对照组喂养一周后,收集尿液样本和血液样本后处死,取骨骼肌组织标本。高脂饮食和加入抗氧化剂的高脂饮食小鼠每隔三周收集尿液和血液样本以及进行ITT实验,并在6周后处死。用ELISA,Western blotting以及Realtime PCR等方法检测各组小鼠尿液中isoprostane、骨骼肌中4-HNE含量、血清胰岛素水平、骨骼肌组织中GLUT4 mRNA水平和骨骼肌细胞核中组蛋白H3和H4乙酰基化水平以及S1P含量。细胞实验选择小鼠骨骼肌C2C12细胞,分别给予BSO、棕榈酸、BSO联合棕榈酸以及抗氧化剂Apocynin与BSO和棕榈酸联合,经过24小时培养后,收集各组细胞,用ELISA,Western blotting,Realtime PCR,CHIP assay 和 Pulldown assay 等方法检测细胞内 4-HNE、MEF2A 和 HDAC1 蛋白水平、GLUT4 mRNA含量、细胞核内MEF2A与GLUT4启动子对应位点结合情况、细胞核内组蛋白H3、H4乙酰基化水平、细胞核内S1P含量、细胞核内S1P与HDAC1的结合以及细胞核内鞘氨醇激酶(Sphk2)和S1P分解酶(SPL)的蛋白含量等。结果在动物实验中,与对照组和6周高脂饮食野生型小鼠比较,6周高脂饮食AM+/-小鼠尿液中排出的氧化应激标志物isoprostane增多,骨骼肌中氧化应激标志物4-HNE蛋白含量增加,提示氧化应激水平增高。此外,6周高脂饮食AM+/-、鼠血清胰岛素水平显著增加。ITT检测结果显示,在胰岛素作用的60分钟时间点上只有6周高脂饮食的AM+/-小鼠血糖值较高,提示氧化应激能够引起胰岛素抵抗。与对照组和6周高脂饮食野生型小鼠比较,6周高脂饮食能够使AM+/-、鼠骨骼肌中GLUT4 mRNA含量减少,提示氧化应激诱导的胰岛素抵抗与骨骼肌GLUT4转录抑制有关。6周高脂饮食能够使AM+/-、鼠骨骼肌细胞核内组蛋白H3和H4乙酰基化水平减低以及细胞核内S1P的含量减少,提示氧化应激通过改变细胞核内S1P水平影响组蛋白乙酰基化来调节GLUT4基因转录。抗氧化剂TEMPOL能够有效拮抗氧化应激所产生的这一系列反应。细胞实验中,与对照组比较,BSO联合棕榈酸组细胞内氧化应激标志物4-HNE的蛋白水平显著增加,提示氧化应激水平增高。氧化应激引起细胞核内S1P分解酶SPL含量增多,而促进S1P合成的Sphk2含量未发生改变。细胞核内S1P分解增多,导致S1P与HDACl的结合显著减少,引起细胞核内组蛋白H3和H4的乙酰基化水平明显减低,导致MEF2A与GLUT4启动子对应位点的结合减少,GLUT4转录水平减低以及mRNA含量减少。抗氧化剂Apocynin能够有效拮抗细胞中氧化应激所导致的SPL增多等一系列反应。结论氧化应激能够引起骨骼肌细胞核内的SPL含量增加,导致S1P分解增多含量减少,从而减少了 S1P与HDACl的结合,削弱了 S1P对HDACl的活性抑制作用,使得HDAC1对组蛋白H3和H4的去乙酰基化作用增强,细胞核内组蛋白乙酰基化水平减低,染色质空间构象改变。这种表观遗传学调控使得GLUT4启动子上MEF2A结合的位点关闭,从而导致GLUT4基因转录被抑制。这种GLUT4基因转录抑制所造成的骨骼肌细胞对葡萄糖摄取利用的减少也是氧化应激诱导的胰岛素抵抗发生的机理之一。本研究同时也证明,抗氧化剂能够拮抗氧化应激诱导的细胞核内S1P含量减少等一系列反应,从而防止胰岛素抵抗的发生。