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海洋原绿球藻(Prochlorococcus)是贫营养大洋的优势自养微型生物,可划分为光生理以及16S rRNA基因系统发育显著差异的两个基本生态型,即高光生态型(High light ecotype,HL)和低光生态型(Low light ecotype,LL)。在高光生态型内部有两个不同的亚类,低光生态型有四个亚类,但近年来研究发现还存在着未知的亚类,所以寻找未知亚类是改善原绿球藻定量研究以及加深了解其环境适应机制的必要途径。
流式细胞仪是研究超微型生物的重要工具,本论文与传统的膜过滤采样方法不同,利用流式细胞仪的分选功能获得原绿球藻浓缩样品,并采用简洁的冻融法提取DNA,通过克隆文库以及变性梯度凝胶电泳法(Genaturing Gradinent GelElectrophoresis,DGGE)对中国南海陆架区域近岸A4站位三个水层(2.2 m、50.7m、75.2 m)以及菲律宾沿岸大洋站位Z97三个水层(5.0 m、30.9m、50.9 m)的分选样品进行了原绿球藻分子生态学研究。
克隆文库的系统发育分析表明:所研究海域的高光生态型原绿球藻以HLII为主;低光生态型四个己知亚类中除以纯培养株系MIT9211为代表的LLIII(该论文中的序号)外其余三个已知亚类均有发现,同时还定义了一个新的LL型亚类LLIV。在垂直分布上,与前人研究结果一致,HL型与LL型在水柱中生态位的分离和表层混合层的深度密切相关。近岸与大洋站位之间的差异主要体现在LL型亚类的组成上。比较近岸A4站位2.2 m、75.2 m的膜样与同水层的分选样品所构建的克隆文库,我们发现膜样存在比较明显的非特异性扩增以及较高的聚球藻百分比含量,所以从扩增的准确性上来说,分选样相比膜样有很大的提高。在原绿球藻种群组成方面,两种采样方法的差异体现在两个层面:生态型亚类组成以及各亚类相对丰度(通过克隆文库计算得到),膜样品与分选样品结果的这种差异还需要加大采样量,才能够得到一个较为统一的结果。
本论文同时利用变性梯度凝胶电泳DGGE技术揭示了不同生境下的原绿球藻多样性。对上升流区断面Z96、Z97、Z99以及珠江口断面A1、A4的研究表明,DGGE作为快速检测原绿球藻的种群研究中是行之有效的技术。
综上所述,流式细胞仪的分选样为海洋微型生物多样性的研究提供了一种新的思路,在克服了少量细胞量提取DNA的困难后,所建立起来的文库构建和DGGE的方法可有效地揭示出中国边缘海原绿球藻的多样性。研究中所发现的LL型新亚类对(定量)PCR引物设计提供重要参考,本研究所展示的中国南海原绿球藻种群组成特征,对原绿球藻的环境适应机制以及全球分布有参考意义。