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头孢曲松(Ceftraxone,CTRX)是第三代头孢类抗生素,其抗菌谱广,抑菌能力强,常被用于动物感染性疾病的治疗。头孢曲松的滥用,易导致人与动物多种系统的疾病,以过敏反应和结石症最为严重。头孢曲松为人用抗生素,目前已被农业部列为禁止用于动物饲养过程的人用药品。目前检测头孢类抗生素残留可采用理化检测法、微生物检测法和免疫学检测法。理化检测法所需仪器设备价格昂贵、专业技术性强及前处理过程繁琐,以上因素决定了此法并不适用于基层大量样品的检测。微生物检测法具有细菌培养耗时较长、特异性不高、准确度低等缺点。免疫学检测法,以酶联免疫吸附法(ELISA)为主,基于抗原抗体的特异性结合,其特异性强、灵敏度高、操作方法简单,适用于大量样品的筛选。1.CTRX完全抗原的合成及鉴定。本研究采用戊二醛法合成两种完全抗原。完全抗原经紫外光谱扫描及SDS-PAGE凝胶电泳分析鉴定,可以初步判定完全抗原偶联成功。完全抗原经免疫小鼠、细胞融合及ELISA测定,最终证明两种完全抗原制备是成功的。利用BCA法测得CTRX-BSA和CTRX-OVA蛋白浓度分别为5.5 mg/mL和5.0 mg/mL。2.CTRX单抗制备。采用常规免疫方案免疫BALB/c小鼠,免疫原使用人工抗原CTRX-BSA,ELISA检测包被原使用CTRX-OVA。在小鼠五免后第7d尾静脉采血,检测血清抗体效价及其药物抑制情况,血清效价达1:16000以上。通过细胞融合技术、ELISA筛选方法和有限稀释亚克隆法获得两株可持续分泌针对CTRX单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E7和7A7。通过小鼠体内诱生法制备腹水,共18 mL,BCA法测其蛋白浓度分别为20.93 mg/mL 和 21.47 mg/mL;效价分别为 32000 和 128000。采用 HiTrap Protein G HP 纯化柱纯化1mL 7A7腹水,得到纯化后的7A7腹水约5 mL,纯化后的蛋白浓度为1.1 mg/mL,蛋白回收率为5.1%。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,腹水纯化效果良好。交叉实验结果表明,该CTRX单抗与头孢氨苄、头孢噻呋、头孢拉定、头孢噻肟、头孢噻吩几乎没有交叉反应,且对CTRX的抑制率为100%。3.ELISA检测方法的建立。利用纯化后的7A7腹水建立检测CTRX残留的CiELISA方法。包被原最佳稀释浓度1:3000,纯化后7A7抗体的工作浓度1:16000。CTRX浓度在1.72～2000 ng/mL时,标准曲线线性关系良好。其线性方程为y=0.2541x-0.0184(R2=0.9875),IC50为108.68 ng/L,LOD 为 1.72 ng/mL,LOQ 为 13.12 ng/mL。4.猪肉中CTRX添加回收实验使用猪肉进行添加回收实验,猪肉样品经过一系列前处理后用于实验测定。实验结果显示样品处理液稀释8倍以上时,基本可以消除样品基质的干扰。在20～1000 ng/mL药物浓度范围内,线性关系良好,线性方程为y=0.4466x-0.4738,相关系数R2=0.9869,IC50 为 150.52 ng/mL,LOD 为 16.38 ng/mL,LOQ 为 44.53 ng/mL。用 50、400、800 ng/mL的CTRX标准品溶液做添加回收实验,经检测猪肉样品回收率在81%～98.7%之间。