组氨酸标签蛋白纯化介质的合成及其应用研究

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蛋白质的分离纯化是发展蛋白组学和进行蛋白质结构功能研究与应用的前提和基础。固定化金属螯合亲和层析(IMAC)利用配体和组氨酸标签蛋白的特异亲和性,是一种灵敏有效的蛋白分离纯化技术。离子液体作为一种绿色溶剂,由于阳离子与阴离子都具有可设计性以及对生物活性分子的化学稳定性,被应用在蛋白质分子的保存以及分离纯化等方面,而近期对离子液体功能化的研究更是为在离子液体绿色溶剂中发挥官能团的特殊功能提供了思路。本课题将IMAC技术和功能化离子液体结合起来,即合成一种金属离子配合作用较强的氮杂大环(TACN),并将这种对组氨酸残基有特异亲和性的配体链接到一种疏水性离子液体上,形成一种亲和性离子液体-离子液体支载TACN的金属螯合物,来和蛋白水溶液液液萃取来一步分离纯化组氨酸标签蛋白,并对这种亲和性离子液体的重复利用能力以及回收再生方法进行探究。主要研究内容如下:(1)以氯丁腈为原料,同氯化氢反应后经关环得到双环咪唑,再与过量的1,6-二溴己烷反应合成烷基双环咪唑阳离子的离子液体;以乙二醇、二乙酰胺为原料磺酰化后经关环、甲基化以及脱除对甲苯磺酰基等步骤来合成功能性配体氮杂大环TACN;将TACN连接到烷基双环咪唑阳离子上,进行阴离子交换使其具有疏水性能,和金属离子螯合后就形成亲和性离子液体AIL。以甲基咪唑和氯丁烷为原料亲和加成,疏水性阴离子交换合成萃取溶剂离子液体(IL):[Bdmim][NTf2]。 NMR、MS、HRMS对重要产物进行结构和纯度鉴定。(2)以组氨酸标签绿色荧光蛋白(His-tagged EGFP)为对象来探究IL,AIL/IL, M2+-AIL/IL (M=Cu、Ni、Zn)三种体系对His-tagged EGFP的亲和性能,并通过荧光强度分析不同体系对蛋白活性的影响。结果表明只有完整的M2+-AIL/IL对目标蛋白具有亲和能力,而且螯合三种金属离子的体系所亲和的EGFP都不同程度地保持了荧光特性。(3)研究了不同离子强度下M2+-AIL/IL (M=Cu、Ni、Zn)对His-tagged EGFP亲和性能的影响。结果表明:Zn2+-AIL/IL和Ni2+-AIL/IL随着离子强度的增大对目标蛋白的亲和能力也提高,而Cu2+-AIL/IL呈现先降低后增长的趋势。说明离子强度可以改变蛋白质分子表面的疏水基团的数量以及和亲和介质之间的静电强度等因素来影响M2+-AIL/IL对组氨酸标签蛋白的亲和能力。同时还以定量的His-tagged EGFP为对象,选取梯度含量的M2+-AIL/IL进行亲和试验,通过亲和目标蛋白的量来判断出对于定量目标蛋白最适宜的M2+-AIL/IL的用量,以便节约成本和发挥亲和介质的最大功效。(4)选定最适宜的离子强度和M2+-AIL/IL的含量,将M2+-AIL/IL应用于从大肠杆菌细胞裂解物中一步纯化目标蛋白His-tagged EGFP。结果表明:Cu2+-AIL/IL对His-tagged EGFP的亲和能力最强,但纯化后的纯度较低;Ni2+-AIL/IL的亲和能力最弱;纯化效果最佳的体系为Zn2+-AIL/IL,纯化效率约为50%,目标蛋白纯度约为90%,并对该体系纯化过程中各组分进行紫外光谱分析。还将Zn2+-AIL/IL应用到了从大肠杆菌表达的粗蛋白中提纯组氨酸标签的青霉素结合蛋白,获得了纯度高达约95%的目标蛋白。(5)离子液体的的重复利用能力以及可回收再生的特性是其独特的优势,通过M2+-AIL/IL连续亲和His-tagged EGFP的过程中亲和性能的变化来探究M2+-AIL/IL的重复利用能力,通过EDTA反复解吸螯合在配体上的金属离子并重新装载的方法来探究再生的亲和离子液体对His-tagged EGFP的亲和性能。结果表明:重复利用的M2+-AIL/IL对目标蛋白的亲和能力显著地下降,但稳定性很好;解吸金属离子再生的M2+-AIL/IL可以很好地恢复亲和性能。
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