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本研究利用随机多态性DNA(RAPD)技术对川西南高山峡谷区的核桃资源进行研究,所选用的109个样本分别来自两州一市的七个县(甘孜州:巴塘县、乡城县、得荣县;凉山州:会理县、美姑县、木里县;雅安市:石棉县)。本试验对扩增反应程序中退火温度和反应体系进行优化。用了120条引物进行初筛与复筛,得到14条随机引物用于聚类分析,建立了UMPGA聚类分析图。结果如下: 1.采用核沉淀法从核桃叶片中提取基因组DNA,经检测表明,核沉淀法能有效的去除核桃细胞内多糖和多酚等杂质对模板DNA的污染,获得的DNA纯度高,可进一步用于核桃分子生物学的操作。 2.着重对影响RAPD-PCRN重复的主要因子和参数进行优化研究,即对Taq DNA聚合酶、Mg2+浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTPs以及PCR扩增中的退火温度进行不同的梯度实验。结果表明如下反应程序和反应体系时扩增效果好、重复性好。建立了适于核桃分子标记的RAPD-PCR反应体系,为该树种进一步的分子生物学研究奠定基础。 反应程序:94℃预变性5min;94℃变性45s;35℃退火45s;72℃延伸90s;40个循环;72℃后延伸10min;4℃保存; 反应体系(25μL反应体系):模板DNA 20ng;10×PCR buffer 2.5μL;Taq酶0.04U/μL;Primer 0.36μmol/L;Mg2+ 2.0 mmol/L;dNTPs 0.15 mmol/L。 3.对120条随机引物进行初筛和复筛,确定扩增产物多态性明显,可获得清晰、重复性好的14条引物用于核桃的RAPD分析。 4.14条引物在109个核桃样本中共扩增出224条谱带,其中多态性条带210条。多态性指数为93.75%。随机引物对核桃扩增的条带数在12~22条之间,多态性条带在11~22条之间,平均每条引物扩增出16条带。 5.对109个样本进行RAPD扩增,所得产物显示了核桃丰富的多态性,表明核桃的遗传基础相当复杂;对核桃的聚类分析结果同地理区划基本吻合。