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随着现代工业的发展，生产中排放的重金属因能在环境中长期积累使其污染成为一个非常严重的环境问题。重金属元素铬(Cr)及铬盐广泛应用于冶金、电镀、皮革、染料等行业，这些行业排放的含六价铬[Cr(Ⅵ)]的废水废渣是环境中铬污染的主要来源。微生物法处理环境Cr(VI)污染与传统的物理化学方法相比具有经济、高效、效果好等许多优点，因此，利用微生物法治理 Cr(VI)污染成为新时期国内外的研究热点。本研究拟从 Cr(VI)污染环境中筛选出耐铬细菌，研究该菌株耐受和还原 Cr(VI)的特性，并从菌株中分离纯化出与 Cr(Ⅵ)还原相关的酶；通过研究铬还原酶的基因序列和其编码的蛋白质及在大肠杆菌中表达后的特性，探索细菌耐受和还原 Cr(Ⅵ)的分子机制，为构建高效除铬工程菌提供理论和实验基础。 主要研究内容和结果如下： 1、探讨耐铬菌株耐受和还原六价铬的特性。从Cr(Ⅵ)污染环境中采集河水和底泥，经逐步升高 Cr(Ⅵ)浓度的含铬培养基筛选出高耐铬菌株CQMUS2。与对照菌大肠杆菌DH5α比较，CQMUS2的Cr(Ⅵ)耐受能力显著高于对照菌(p<0.001)。CQMUS2在高Cr(Ⅵ)环境中生长较低Cr(Ⅵ)环境减缓，Cr(Ⅵ)还原能力消失。在中性环境中CQMUS2生长正常，Cr(Ⅵ)还原能力最强；在弱酸性环境中几乎不生长，还原Cr(Ⅵ)的能力最弱。在环境温度高时还原 Cr(Ⅵ)的能力大；随着环境温度降低，菌株的生长减缓、Cr(Ⅵ)还原能力降低。Pb2+、Hg2+、Cd2+、Cu2+能抑制CQMUS2的生长，酚和NH4+对生长起促进作用。CQMUS2为革兰氏阴性球菌或短杆菌，16srDNA鉴定结果表明其属于沙雷氏菌属。透射电镜结果表明CQMUS2中Cr(Ⅵ)还原发生在细菌内部，可初步确定具有Cr(Ⅵ)还原能力的物质存在于细胞质中，有分离出来的可能性。 2、CQMUS2中铬还原酶的分离、纯化和鉴定。探索细菌CQMUS2中总蛋白的提取条件，通过正交实验确定超声破碎法提取蛋白质的条件。确定硫酸铵百分饱和度为40-50％。通过比较铬还原酶在不同的pH缓冲液及离子强度条件下与阴离子交换剂的作用效果，选择含0.2-0.7 mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.5)为离子交换层析洗脱液；离子交换层析结果显示具有铬还原能力的物质有多种，以比活力最高者为进一步研究对象。凝胶过滤层析后以比活力最高者为铬还原酶，初步判断该酶的相对分子质量为50 kD左右。SDS-PAGE结果显示分离纯化后得到单一的铬还原酶，且该酶由一条肽链构成，其分子质量约为50kD。铬还原酶经MALDI-TOF-MS检测，通过MASCOT检索出与其肽质量指纹图谱符合率最高的已知蛋白质是NADH醌氧化还原酶亚基D(NqoD)。 3、铬还原酶的酶学特性研究。铬还原酶在分离纯化过程中酶活力大增加，为粗酶液的940倍。酶反应的最适pH为7.5，在近中性的环境中酶的活性和稳定性都很好。酶活性随着温度的升高而增大，在70℃达到最大；酶的热稳定性在≤45℃时无明显变化，然后随着温度升高而降低；酶反应的最适温度为50℃。酶的Km为2mg/L，反应的最适底物浓度为20mg/L。加入NADH后酶活性大大地增加，为加入前的2.3倍，说明NADH确实是铬还原酶的辅酶，能起到催化反应的作用。 4、铬还原酶 NqoD基因克隆和序列分析。在 BLAST检索与CQMUS2的NqoD最相近的DNA碱基序列后，用primer premier5.0设计其PCR引物2对。确定PCR反应条件，利用温度梯度法确定反应能够进行的退火温度，利用正交实验探索较优PCR体系，结果表明仅引物2满足研究需要。引物2的PCR产物的DNA测序结果表明该片段全长351bp，编码116个氨基酸。该DNA序列与多种细菌的基因序列有80%以上的相似性；其氨基酸序列与多种微生物的NqoD、NuoD、NdhD等酶有70%以上的相似性，说明了此酶是广泛存在的。 5、铬还原酶 NqoD基因的表达研究。NqoD基因片段分别与pMD19-T克隆载体和pCold表达载体连接，重组质粒转化于大肠杆菌DH5α中；用蓝白斑实验筛选重组阳性克隆；碱裂解法提取重组克隆质粒，经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果表明重组克隆质粒中确实存在着目的基因片段；重组表达载体在大肠杆菌中进行表达，其Cr(Ⅵ)耐受和还原实验结果显示，表达后大肠杆菌对Cr(Ⅵ)的耐受比对照菌强，而对 Cr(Ⅵ)的还原能力两菌没有显著差异，说明目的基因得到了表达，但表达率先反映在对 Cr(Ⅵ)的耐受能力上，还不足以还原Cr(Ⅵ)。 研究结论：耐铬沙雷氏菌CQMUS2具有高度耐受和还原Cr(Ⅵ)的能力，从其细胞内纯化出铬还原酶NqoD，并进行了NqoD基因克隆和表达的研究。本文在国内率先进行了铬还原酶的纯化和 NqoD的基因克隆和表达研究，为利用基因工程技术构建高效除铬工程菌及利用微生物治理环境污染提供了分子水平的理论和实验基础。