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MTOR是一种细胞增殖、凋亡及生存的主要调节分子。MTOR抑制剂,如雷帕霉素,具有免疫抑制作用及抗肿瘤效应。而依维莫司作为雷帕霉素的一种衍生物,也有着抑制MTOR活性的药物学功能。然而,依维莫司是否有抗肿瘤效应却不明确。我们发现使用依维莫司处理人皮肤鳞状细胞癌系COLO-16细胞后,MTOR磷酸化水平下降,LC3-I向LC3-II的转化增加,但自噬流却并未增强;凋亡标志分子caspase3和PARP也并未发生剪切分裂。同时我们也发现依维莫司单独处理细胞时,细胞死亡的一些关键通路并未受到影响;但是与顺铂共同处理细胞时,增强了顺铂诱导的细胞死亡。依维莫司并没有影响顺铂诱导的细胞凋亡,而Chk1(检测点激酶1)的激活却受到了抑制。我们研究证实,依维莫司通过抑制检测点激酶1的激活增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡,而且这种效应不依赖于凋亡和自噬调控,发现了依维莫司新的药物效应作用机制。【目的】探讨依维莫司对顺铂的抗人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞效应的增效机制。【方法】分别用50、100、200nmol/L的依维莫司和25μmol/L顺铂处理人皮肤鳞状细胞癌系COLO-16细胞12、24小时,用AO标记自噬体囊泡并结合溶酶体酶抑制剂分析自噬和自噬流水平。Western印迹分析自噬标记性分子LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化、凋亡和细胞周期相关信号通路,并检测MTOR通路、Chk1磷酸化水平、caspase3和PARP剪切;LDH释放实验分析细胞死亡;AnnexinV-EGFP染色分析细胞凋亡。依维莫司与顺铂联合处理的机制实验通过Western印迹进行MTOR、Akt、DNA损伤相关信号以及Chk通路分析。【结果】50、100、200nmol/L的依维莫司处理COLO-16细胞12、24小时后,MTOR2448位点和2481位点的磷酸化水平降低,Rictor1135位点磷酸化水平也降低。然而,下游信号ULK1蛋白的ser757位点的磷酸化水平、P70S6激酶的thr389位点的磷酸化水平的变化并不显著。12小时LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化率分别为3.52±0.21、4.03±0.39、5.05±0.22,两两之间比较,差异无统计学意义(P>0.05),与未用药物处理的对照组(2.07±0.05)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。24小时LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化率分别为3.38±0.26、3.29±0.06、6.57±0.16,两两之间比较,差异无统计学意义(P>0.05),与未用药物处理的对照组(2.61±0.16)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。50、100、200nmol/L的依维莫司联合E64d、pepstatin处理COLO-16细胞12小时后,LC3-Ⅱ与β肌动蛋白的比值分别为1.26±0.40、1.16±0.34、1.21±0.39,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.19±0.27)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。100nmol/L依维莫司联合E64d、pepstatin自噬体囊泡表达阳性率2.06±0.61,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.68±0.62)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。依维莫司处理对Akt的总蛋白水平和磷酸化水平无明显影响。顺铂单独处理COLO-16细胞12、24小时,其中12小时细胞死亡率(%)14.33±3.07,24小时细胞死亡率(%)18.20±1.46。依维莫司单独处理细胞12、24小时时:12小时细胞死亡率(%)0.82±0.47,24小时细胞死亡率(%)8.75±1.17,而顺铂和依维莫司联合处理细胞12、24小时,12小时细胞死亡率(%)28.27±2.12,24小时细胞死亡率(%)42.58±0.93,细胞死亡率明显高于顺铂单独处理时的死亡率。顺铂处理细胞24小时后诱导了caspase3和PARP的剪切分裂,另外,顺铂处理细胞后,膜联蛋白(annexin)和碘化丙啶(PI)标记的细胞数目增多。而且,顺铂单独处理细胞和联合依维莫司处理细胞24小时,caspase3和PARP的剪切分裂没有明显的差异,膜联蛋白(annexin)和碘化丙啶(PI)标记的细胞数目也没有明显差异(P>0.05)。而且,顺铂单独处理细胞组与联合依维莫司处理细胞组处理细胞12、24小时LC3-Ⅱ形成、caspase3和PARP剪切、AnnexinV标记细胞数均无统计学差异(P>0.05)。顺铂处理COLO-16细胞12、24小时后,Rictor的thr1135位点磷酸化水平和Chk1的ser345位点磷酸化水平明显升高,依维莫司单独处理无类似效应。依维莫司与顺铂联合处理后12和24小时,相对于顺铂单独处理的细胞,上调的Chk1和Rictor磷酸化水平受到明显抑制。【结论】1.依维莫司增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡,这种效应不依赖于凋亡和自噬调控。2.COLO-16细胞MTOR通路对依维莫司处理敏感,但其下游信号并非同步产生级联反应。细胞凋亡、Akt通路对依维莫司处理不敏感。3.依维莫司通过抑制检测点激酶1的激活增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡,但无加重顺铂所导致的DNA损伤。