研究背景Weinberg等提出了肿瘤的几个标志性特征：自给自足的生长信号,抗增长抑制和细胞死亡的能力,血管生成和无限制自我复制能力,侵袭和转移能力,逃避免疫杀伤,诱导炎症发生,细胞能量异动以及基因组的不稳定性和突变性。事实上,肿瘤细胞生存在一个动态变化中的微环境里面。肿瘤的快速生长能力会诱导大量的细胞内来源或者细胞外来源的压力的产生。当肿瘤的生长速度超过血液供应速度的时候,就会出现养料和氧气匮乏的现状。虽然肿瘤细胞对此具有一定的耐受能力,但细胞内的能量代谢会受到抑制,细胞可能因此死亡。缺氧会导致细胞核内DNA降解,导致细胞坏死或凋亡的出现。应激反应发生后,细胞内质网内会激活未折叠蛋白反应(UPR)从而减轻内质网负荷,持续性蛋白质合成的抑制会造成细胞的生长停滞。一般情况下,癌细胞是处在氧化应激环境下。过量的活性氧簇(ROS)的产生会引起细胞死亡。面对如此之多的各种不利的内外压力,肿瘤细胞已经形成了一套称之为整合应激反应(ISR)的应激反应系统。真核生物翻译起始因子2α(eIF2a)在整合应激反应中发挥重要作用。eIF2a的磷酸化会抑制蛋白质合成,但同时也会增强了一些特殊蛋白的翻译,如活化转录因子4(ATF4)。ATF4表达的上调将开启整合应激反应系统中一系列基因的转录程序。比如天冬酰胺合成酶(ASNS)和转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP).整合应激反应有助于肿瘤细胞耐受各种压力环境。与此同时,整合应激反应的持续活化又可以通过蛋白质合成的抑制和细胞凋亡的激活造成细胞死亡。OLA1, Obg like ATPase 1,被认为在细胞蛋白质翻译和降解过程中发挥调控作用。但是,对其功能和相关机制的认知甚少。在本文里面,我们提出OLA1是作为整合应激反应的一个新的调控因子,OLA1的表达对乳腺癌的发展具有重要作用.研究内容本位主要以乳腺癌细胞系231-D3H2-LN (MDA-MB-231-luc-D3H2LN)作为对象研究了OLA1蛋白对肿瘤生长转移能力的影响以及OLA1在整合应激反应(ISR)中的调控作用。研究内容主要包括三个部分：(一)OLA1对肿瘤细胞体内生长转移的影响；(二)体外实验研究OLA1对细胞压力应激反应的调控以及OLA1的下游调控蛋白；(三)OLA1作为乳腺癌的一个预后指标的可行性研究。(一)OLA1对肿瘤细胞体内生长转移的影响利用慢病毒感染构建231-D3H2-LN OLA1表达敲低的稳定细胞株以及对照组。将细胞等量注射到裸鼠脂肪垫。三周后,OLA1敲低表达肿瘤组生长速度明显快于对照组。有趣的是,体外实验表明OLA1对肿瘤细胞生长的影响是很小的。第二次动物实验中,我们在SCID小鼠的脂肪垫上接种231-D3H2-LN稳定细胞株。IVIS(体内成像系统)结果发现,OLA1敲低组中的淋巴结转移比率为84.6%(11/13),超过了对照组的38.5%(5/13)。组织病理学研究进一步确认小鼠淋巴结和肺的转移情况。我们发现,OLA1低表达组中发生了更多的淋巴结转移(20个,对照组9个)和肺转移(6例,对照组2例)。OLA1表达的下调会增强肿瘤转移能力。Western blot研究肿瘤组织中的蛋白质表达情况。我们发现在OLA1敲低肿瘤中,p-GSK-3β, p- p70S6K, p-eIF2α, ASNS和CHOP的表达下调。免疫组化染色证实了OLA1的下调会引起CHOP表达的降低以及细胞凋亡的减少。Ki67染色结果则显示,OLA1的表达与对细胞增殖没有影响。OLAl的抑制对乳腺癌细胞在体内生长和转移具有促进作用,同时会影响肿瘤ISR通路中相关蛋白表达的变化。(二)体外实验研究OLA1对细胞压力应激反应的调控以及相关下游调控蛋白为进一步研究OLA1对肿瘤细胞整合应激反应的影响,体外实验中我们对231-D3H2-LN稳定细胞株进行血清饥饿处理,氨基酸饥饿处理,内质网应激反应诱导处理(tunicamycin)或氧化应激诱导处理(H2O2)。相比较对照组,OLA1表达敲低组细胞更能耐受各种压力,细胞的存活比例也更高。Western blot结果表明,血清饥饿处理72小时后,OLA1低表达组中,p-eIF2a和p-GSK-3β的水平显著降低。在氨基酸饥饿条件下,OLA1敲低组中GCN2-p-eIF2α- ATF4表达水平明显低于对照组。同样的,在内质网应激或氧化应激条件下,OLA1低表达组里面观察到下调的PERK-p-eIF2α- ATF4-ANSN。35S标记方法是用来检测细胞中蛋白质的翻译速率。在血清饥饿或内质网应激条件下,OLA1敲低231-D3H2-LN细胞株中蛋白合成水平显著增高。以上结果表明,OLA1的抑制会降低乳腺肿瘤细胞整合应激反应通路中相关蛋白的表达并增强乳腺癌细胞在压力条件下的生存能力。OLAl-rescue实验进一步验证了这个观点。在OLA1敲低表达的稳定细胞株中,我们利用质粒转染方法将OLA1表达上调。结果发现,OLAl表达的回升同时伴随着整合应激反应通路中PERK-elF2α- ATF4表达的上调。在进一步的免疫共沉淀(IP)实验中我们发现,OLA1与eIF2α蛋白之间具有直接的相互作用。(三)OLA1作为乳腺癌的一个预后指标的可行性研究采用免疫组织化学方法对160例乳腺癌临床标本进行了OLA1蛋白表达情况的检测,结合临床病理资料及随访情况分析。Kaplan-Meier生存曲线表明,OLA1的低表达组中乳腺癌的复发时间更早(log-rank:p=0.024),乳腺癌患者术后生存更差(log-rank:P=0.033).多因素Cox比例风险模型分析表明,OLAl的表达水平和乳腺癌的复发风险(HR:0.540,95%CI:0.345.0.844,P=O.007),乳腺癌患者的术后死亡风险(HR:0.514,95%CI:0.292.0.905,P=0.021)均呈现负相关关系。OLA1的低表达预测预后不良的乳腺癌患者。结论与创新截止到现今,关于OLA1机制的研究少之又少,其中多数集中在原核生物中。实际上,OLA1的表达对真核生物,对肿瘤细胞的内部各种机理的调控是极为重要的。OLA1不仅会影响细胞内蛋白合成,还会调控肿瘤细胞内整合应激反应(ISR)信号通路的改变。1.本文第一次提出了OLA1作为肿瘤细胞整合应激反应的潜在的一个调控因子。OLA1的敲低会引起肿瘤细胞中ISR通路中相关蛋白的下调,同时提高细胞对体外各种压力刺激的耐受能力和生存能力。进一步的,细胞内OLA1和eIF2a蛋白是直接互相结合的,提示了OLA1是如何影响ISR通路的变化。2.本文第一次检测了OLA1对乳腺癌细胞在小鼠体内生存和转移能力的影响。OLA1对肿瘤细胞在体外生长的影响不大,但是其低表达会促进乳腺癌细胞在小鼠体内的生存和转移能力。3.本文第一次验证了OLA1作为乳腺癌患者预后的一个指标的可能性。OLA1的表达水平可以用于预测乳腺癌患者的复发和术后生存情况。