论文部分内容阅读
背景：肺癌细胞对化疗的耐受是肺癌患者治疗失败的主要原因之一。在目前所用的肺癌治疗方案中，顺铂是最常用的一线化疗药物，它的主要作用机制是与DNA形成加合物，抑制细胞转录及翻译，促使肿瘤细胞凋亡。近年来的研究表明：肺癌易对顺铂产生耐药，导致治疗失败，是目前肺癌研究的热点之一；其主要机制尚未完全阐明。近年来的研究表明：PI3K/AKT通路在肿瘤顺铂耐药过程中发挥了重要作用。AKT1过表达导致肺癌细胞对顺铂耐药， AKT1表达的抑制可以逆转肺腺癌多药耐药（MDR）细胞株A549/CDDP的顺铂耐药性。对其机制的研究则表明：AKT1通过mTOR-P70S6K1信号途径诱导肺癌细胞对顺铂耐药。CA916798是我们通过消减抑制杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技术在人肺腺癌MDR细胞系SPC-A-1/CDDP中发现的肺癌耐药相关基因。CA916798的过表达导致对顺铂敏感的小细胞肺癌细胞株H446对顺铂耐药：顺铂作用后，NCI-H446/CA916798细胞与空载体转染组细胞比较，生长增殖速度加快，细胞凋亡率下降，对多种抗肿瘤药具有抗药性。可以看出，与AKT1通路相似，CA916798也具有通过抑制药物诱导的凋亡进而诱导肿瘤细胞耐药的作用。由此我们推测两者在体内存在相互作用的可能。研究两者之间的关系无疑有助于深入了解CA916798诱导肺癌细胞顺铂耐药的作用机制。生物信息学预测显示：CA916798蛋白可能包含1个硫酸酪氨酸位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点和3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，提示该蛋白可能与信号转导有关。在PI3K-AKT-mTOR-P70S6K1通路中，除PI3K外，其余3个均是丝、苏氨酸激酶，它们被激活后均是通过对含有丝、苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥作用。推测肺癌耐药相关基因CA916798可能是AKT信号通路作用的底物或靶点。但由于该蛋白与其它已知蛋白无同源性，我们对其所知甚少，不能排除其作为PI3K/AKT通路上游信号发挥作用的可能。为此，本研究试图利用人肺腺癌A549细胞株观察抑制CA916798对PI3K/AKT/mTOR通路主要成员表达的影响，同时观察抑制或激活PI3K/AKT/mTOR通路对CA916798的影响，从正反两个方面初步探讨两者之间的关系。目的：观察CA916798与PI3K/AKT/mTOR通路之间是否存在相互作用并初步探讨具体的作用方式，为进一步研究CA916798诱导肺癌顺铂耐药的机制并寻找新的逆转耐药方法提供基础。方法：（1）观察对比耐化疗与对化疗敏感的肿瘤组织标本中CA916798、P-AKT、P-mTOR表达情况。（2）免疫共沉淀及免疫双荧光实验观测A549和A549/CDDP细胞系中CA916798、P-AKT1结合及共同分布的情况，初步探讨两者之间的关联与肺癌顺铂耐药的联系。（3）建立持续激活或抑制AKT1表达的A549和A549/CDDP细胞系，观测CA916798、AKT1、mTOR mRNA及蛋白表达（包括总蛋白和磷酸化蛋白）的变化。（4）在分别抑制PI3K、CA916798、mTORC1/2表达的情况下，同上观察CA916798、AKT1、mTOR的mRNA及蛋白水平表达变化。结果：（1）CA916798、P-AKT、P-mTOR在耐化疗患者肺癌病理标本中表达均显著高于对化疗敏感的患者，三者具有相同的变化趋势。（2）CA916798与P-AKT1在体内存在结合，且两者的结合在顺铂耐药的肺腺癌细胞株A549/CDDP中显著强于普通亲代A549细胞系。（3）抑制P-AKT1（AKT1-K179M、AKT1-siRNA、LY294002）均显著下调了A549、A549/CDDP细胞系中CA916798mRNA及蛋白的表达水平。而P-AKT1持续激活则显著增加了A549、A549/CDDP细胞系中CA916798mRNA及蛋白的表达水平。（4）抑制mTORC1显著抑制了A549、A549/CDDP细胞的CA916798表达；抑制mTORC2（Rictor-siRNA）后亦导致A549、A549/CDDP细胞CA916798mRNA及蛋白水平的表达显著下调。（5）抑制CA916798对A549、A549/CDDP细胞PI3K/AKT通路主要成员mRNA及蛋白的表达水平无显著影响。结论：（1）CA916798是PI3K/AKT/mTOR通路下游靶点。（2）PI3K/AKT/mTOR通路可能在转录水平上调控CA916798，这可能是CA916798诱导肺癌顺铂耐药发生的重要机制之一。