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目的:牵张成骨(distraction osteogenesis,DO)是一种广泛使用的手术技术,可控的机械力间断施加于断裂骨端,以增强再生过程并在牵张间隙中诱导新骨形成。由于骨骼是高度血管化的器官,所以我们认为血管新生的过程是骨形成过程中的重要组成部分。EPCs参与血管生成的过程受到促血管生成物质及抑制血管生成物质的调控。通过检测TRPC的mRNA和蛋白,发现在培养的的血管内皮细胞和完整的血管内皮中表达各种类型的TRPC家族成员,其中TRPC4是TRPC家族的重要成员,主要存在于血管内皮细胞中,TRPC4参与的生理过程也主要集中于心血管系统。本实验应用EPC作为种子细胞,构建慢病毒载体介导的siRNA沉默TRPC4基因,筛选出沉默效果最佳的siRNA,将最佳沉默效果的慢病毒载体介导的siRNA转染EPCs。研究TRPC信号转导通路在牵张区新生血管的相关分子调控过程,为进一步阐明牵张成骨模式中的新生血管形成机制提供理论依据。方法:1.犬内皮祖细胞(EPCs)体外分离培养及鉴定:取3周大健康杂种犬,于双侧胫骨穿刺抽取胫骨骨髓,采用密度梯度离心法结合特殊诱导培养基贴壁培养法分离培养犬骨髓内皮祖细胞;通过倒置相差显微镜观察细胞形态;通过流式细胞仪检测细胞表面标志物;通过Matrigel小管形成实验检测犬内皮祖细胞管腔形成的能力;免疫组化实验检测TRPC4基因是否在内皮祖细胞上表达。2.慢病毒介导的TRPC4-siRNA转染EPCs:构建TRPC4干扰慢病毒表达载体,测定病毒滴度,检测质粒表达情况;取犬第2代EPCs,用慢病毒作为载体介导TRPC4干扰基因转染入犬EPCs中,测定感染细胞最佳MOI;在荧光显微镜下观察细胞转染情况;采用荧光定量PCR法检测慢病毒转染后TRPC4在EPCs的mRNA表达情况。3.沉默TRPC4基因对EPCs生物学行为功能的影响:采用CCK-8法检测沉默TRPC4对EPCs增殖的影响;Transwell小室考察沉默TRPC4后EPCs跨内皮迁移的能力;粘附实验考察沉默TRPC4后EPCs对内皮粘附能力的影响;Matrigel小管形成实验查看沉默TRPC4后EPCs管腔形成能力的影响;ELISA法检测慢病毒转染EPCs后,TRPC信号下游信号分子VEGF和SDF-1的蛋白表达情况。结果:1.内皮祖细胞的形态:内皮祖细胞贴壁后少量细胞呈现纺锤形,贴壁的大量的梭形细胞从中间向周围呈放射性生长,此时细胞呈现血岛样典型结构,外围梭形细胞最终融合形成典型的“铺路石”样结构生长;流式细胞仪检测CD133、CD34两种标记物的共存认为该细胞为EPCs;Matrigel小管形成实验表明,该细胞可以形成毛细血管样管腔结构,说明EPCs有形成新生血管的能力,免疫组化实验观察到TRPC4抗体阳性表达。2.成功构建了TRPC4干扰慢病毒表达载体,犬内皮祖细胞感染慢病毒MOI值为10;荧光定量PCR法检测到慢病毒转染后TRPC4 mRNA相对表达量明显下降(P<0.05),且其中一个设计靶点的相对表达量最低,认为该组沉默效果最好,后续实验即用该设计靶点慢病毒转染细胞沉默TRPC4基因。3.CCK-8法检测沉默TRPC4基因降低了EPCs的增殖(P<0.05);沉默TRPC4基因降低了EPCs跨活化内皮迁移能力(P<0.05),降低了EPCs活化内皮粘附能力(P<0.05),降低了EPCs管样结构形成能力。ELISA法检测慢病毒转染EPCs培养上清液后结果显示,TRPC信号下游信号分子VEGF和SDE-1的蛋白表达均降低(P<0.05)。结论:1.通过慢病毒介导的基因转染方法成功地获得了稳定低表达TRPC4基因的EPCs。2.沉默TRPC4基因减少了EPCs增殖,且使细胞对活化内皮细胞的粘附、跨内皮迁移以及管腔样结构的形成能力均降低,还下降了TRPC信号下游信号分子VEGF、SDF-1蛋白的表达;导致血管形成能力的降低。