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牙周病是一种常见和多发的口腔慢性疾病。在彻底清除了牙周组织感染的基础上,利用生物膜引导牙周组织再生是目前国内外用来治疗牙周病最常用的方法。但是牙周支持骨组织的重建是一个复杂的过程,如何使缺失的骨组织再生及恢复,在世界范围仍然是一个具有挑战性的问题。传统的引导骨组织再生术中的所采用的生物膜多数只能起到物理屏障作用,对于诱导牙周组织修复与再生存在一定的局限性。基因活化基质(gene activated matrix,GAM)作为一种新的组织工程方法,将生物支架材料和质粒载体相结合,形成了一种基因局部释放系统。相比直接使用外源性生长因子,GAM支架内基因表达所产生的蛋白质具有相对较低的成本和长期效应,因此其相关的制备与研究越来越成为关注的热点。骨的重建修复是一个复杂的过程,是骨的生成与吸收同时存在的动态过程。骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)在破骨细胞的发生、分化中起核心作用,不但能够通过抑制破骨细胞的分化及活性来抑制骨组织的吸收过程,还可以通过诱导碱性磷酸酶和钙化结节的形成来促进成骨,从促进生成和抑制吸收两方面促进骨组织的修复重建。通过静电纺丝技术制备的生物支架材料,其结构具有类似于细胞外基质的自然形态,具有超细直径和较大比表面积的特点;有利于细胞迁移和组织的生长、营养物质的摄入和代谢废物的排放。同轴静电纺丝技术可以分别将两种物质置于纤维的芯层和壳层,避免了壳层的有机物与芯层的生物活性物质的直接接触,保存了生物分子的活性。因此同轴静电纺丝技术被广泛的用于生物活性支架的制备。研究目的:通过同轴静电纺丝技术,制备以聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)包裹的骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)质粒微球为芯层,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)为壳层的PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM;检测GAM纤维的微观形貌、力学性能以及OPG基因的释放速度,通过细胞实验和动物实验检测这种载OPG基因GAM的生物相容性、基因转染效率、表达以及成骨情况。研究方法:1、双酶切制备载体,钓取并扩增目的片段,构建pDsRed2-N1-hOPG重组质粒,经过PCR和基因测序鉴定质粒。最后大量扩增、提取重组质粒。2、采用同轴静电纺丝方法制备PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM,并检测了芯-壳型纤维的表面形态、内部结构以及力学和缓释性能。3、将牙周膜干细胞与PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM共培养后,通过MTT实验检测GAM的细胞毒性;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测OPG基因对牙周膜干细胞的转染情况;通过RT-PCR和Western Blot检测OPG的表达情况;利用破骨细胞分化抑制实验检测OPG的活性。4、构建SD大鼠颅骨极限缺损模型,植入PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM,饲养8周后处死,通过Micro-CT重建与测量以及组织学切片染色来研究PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM在组织内诱导成骨的情况。研究结果:1、成功双酶切GV147质粒载体,PCR技术钓取出目的基因片段,大小为1245bp,与质粒载体进行成功重组后,获得后续实验需要的重组质粒pDsRed2-N1-hOPG。并通过PCR以及基因测序证实了所构建质粒的准确性。最后通过大肠杆菌成功扩增并提取了大量高纯度的重组质粒。2、利用同轴静电纺丝技术制备出的PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM具有光滑表面,纳米级的纤维直径,透射电镜下可检测到处于芯层的OPG质粒微球。该PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM具有合适的力学性能,以及超过30天的稳定缓释性能。3、PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM经过与牙周膜干细胞共同培养后,MTT测试发现其基本没有细胞毒性,并表现出高达90%的转染效率;RT-PCR及WB检测后发现,OPG质粒从PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM释放后能够转染进入目的细胞内,并能够在细胞内持续表达;经过诱导RAW264.7分化破骨细胞抑制实验我们发现,该PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM表达的OPG蛋白能够明显抑制破骨细胞样细胞的发生。4、GAM植入SD大鼠颅骨极限缺损模型8周后,切口均愈合良好。经过Micro-CT重建与测量后发现SD大鼠颅骨极限缺损重建了40%,和组织切片染色的结果一致,表明PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM可以提高大鼠颅骨骨缺损的重建修复速度。结论:本研究通过同轴静电纺技术成功制备出芯层为以PEI为载体包裹的OPG质粒微球,壳层为PLGA的纳米级PEI/pOPG-PLGA芯-壳型GAM,该GAM具有合适的形态结构、力学性能以及稳定的缓释性能;表现出较高的生物安全性以及转染效率,可以持续的在目的细胞内表达出具有生物活性的OPG蛋白,同时在SD大鼠体内可以明显提高局部骨组织修复重建的速度。本研究为进一步将芯-壳型GAM应用于大动物、临床试验以及最终的牙周病治疗提供了理论依据和基础。