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从人心肌中提取cTnⅠ是不现实的，原核细胞表达人cTnⅠ产量较低，重组蛋白的结构和功能常常受到破坏。本文研究在真核细胞中分泌性表达人cTnⅠ，以及重组蛋白的结构和功能。 从人心肌细胞中提取RNA，RT-PCR获得人cTnⅠ cDNA。A-T克隆法将人cTnⅠ cDNA片段插入到质粒pBlueScript SK(+)的EcoRⅤ酶切位点，构建质粒pBSTnⅠ。 用SnaBⅠ，EcoRⅠ酶切pBSTnⅠ获得cTnⅠ cDNA，将cTnⅠ cDNA定向插入到pPIC9的α-信号肽编码基因的下游，构建了真核表达质粒pPIC9TnⅠ。DNA测序证实cTnⅠ cDNA被正确地克隆到α-信号肽的编码阅读框内。 质粒pPIC9TnⅠ经LiCl2-PEG法转化毕氏巴斯德酵母菌GS115株，0.5％甲醇诱导，成功地分泌表达了重组蛋白rcTnⅠ，Western Blot显示重组蛋白可以与人cTnⅠ单克隆抗体发生特异反应。 TnC-Sepharose4B亲和层析法纯化重组蛋白，首先用含Ca++洗脱液充分洗涤杂蛋白，再用含EGTA的洗脱液将重组蛋白洗脱。SDS-PAGE显示为单一条带，测定分子量约为24.3KD，等电点9.84。 Antheprot蛋白分析软件预测其二级结构中包括4个α-螺旋区(H1:43S-79C，H2:90A-135R，H3:150A-159G，H4:164E-188G)，4个β-片段区，1个N-糖基化位点(123NITE)，4个PKA磷酸化位点(22RRRS，23RRSS，38KKKS，142KRPT)，5个PKC磷酸化位点(46SRK，79STR，131TQK，145TLR，183TRK)。氨基酸序列与天然人cTnⅠ相比，其N端多三个氨基酸(YVM)，同源性为99.5％。 为了验证重组蛋白结合TnC的能力，采用Sephadex G-75(1.6×15cm)进行rcTnⅠ-TnC共纯化，将rcTnⅠ与TnC等摩尔混合，在有Ca++的环境下洗脱，发现了三个洗脱峰，说明rcTnⅠ与TnC在体外发生了特异结合，形成了一个分子量较大的复合物。 为了进一步验证重组蛋白与TnC结合的特异性，我们将cTnⅠ、TnC1∶1混合，分别在有钙离子(5mmol/l CaCl2)和无钙离子(5mmol/l EGTA)环境中进行电泳，电泳介质为碱性尿素聚丙烯酰胺凝胶。电泳结果显示rcTnⅠ在钙离子存在的条件下能与TnC特异结合，而在无钙环境中(5mmol/l EGTA)不能与其结合。 为了研究重组蛋白对Acto-S1 ATP酶活性的抑制作用，我们进行了ATP酶活性抑制试验和TnC反抑制试验。ATP酶活性抑制试验体系由Acto-S1，F-肌动蛋白，MgCl2，ATP和不同浓度的rcTnⅠ(0-3μM)组成。TnC反抑制试验体系由Acto-S1，F-肌动蛋白，MgCl2，ATP，rcTnⅠ(3μM)和不同浓度的TnC(0-3μM)组成。结果表明rcTnⅠ在体外可以抑制肌浆蛋白Mg-ATP酶的活性，而且这种抑制作用可以通过加入TnC解除; 为了进一步研究重组蛋白在体内与TnC相互作用的能力，我们采用了酵母双杂交技术。首先用引物P_pAS-2-1_TnC_UP和P_pAS-2-1_TnC_Down从质粒pET15b中扩增出TnC编码区全长cDNA，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后与pAS2-1相连，构建了含GAL4 BD和TnC编码基因的表达质粒pAS-2-1-TnC。用P_ACT2_TnⅠ_UP和P_ACT2_TnⅠ_Down从质粒pBSTnⅠ中扩增出cTnⅠ全长cDNA，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后与pACT2相连，构建了含GAL4 AD和cTnⅠ编码基因的酵母表达质粒pACT2-TnⅠ。将上述质粒用LiCl2-PEG法转化酵母菌株SFY526，在SD/Trp-Leu-培养基上用底物X-GAL检测β-半乳糖苷酶活性，进行筛选阳性菌落。试验结果表明，重组蛋白rcTnⅠ在细胞内能与TnC进行特异结合。 结论:本研究论文通过对人cTnⅠ cDNA克隆、酵母表达质粒pPIC9TnⅠ构建、酵母菌GS115株分泌表达cTnⅠ及重组蛋白结构和功能的研究，表明人cTnⅠ可以在酵母菌GS115中分泌，表达的重组蛋白尽管与天然cTnⅠ相比，其N端多三个氨基酸(YVM)，但在体内外均具有特异结合TnC的能力，而且和天然cTnⅠ一样可以特异抑制Acto-S1 ATP酶的活性。 研究意义与创新点:这项研究首次建立了在真核细胞中高效表达人cTnⅠ的途径，为在国内开展cTnⅠ体外诊断试剂研制提供原料支撑，而且可以用来代替天然cTnⅠ，在体外构建Tn复合物代谢模型，模拟cTnⅠ在人血液循环中的环境，进一步研究cTnⅠ的酶解、磷化化修饰、糖基化修饰、与其他蛋白（如TnC、TnT、自身抗cTnⅠ抗体）结合等对cTnⅠ测定标准化的影响。