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目的:(1)制备研究ABC现象的模型制剂PEG-GNA-Liposomes,选出最优工艺与处方,并对其进行表征;(2)证明模型制剂PEG-GNA-Liposomes二次注射具有ABC现象,并考察前后两次注射间隔时间及剂量对该现象强弱的影响,与此同时考察各组肝、脾组织药物蓄积量;(3)从血液学与组织学水平分别对ABC现象的产生机制进行初步探讨。旨在为最终消除PEG化纳米载体二次注射产生的ABC现象提供解决思路。方法:(1)参考实验室前期研究,并以包封率为主要考察指标,结合单因素考察与正交试验,最终确定用溶剂注入法制备PEG-GNA-Liposomes的最优处方,并通过扫描电镜、粒径、Zeta电位、体外释放等对最优处方下的PEG-GNA-Liposomes进行表征;(2)确定以HPLC法检测血浆与肝、脾组织中GNA的方法。通过将首次注射PEG-GNA-Liposomes与二次注射后药时曲线下降的速度作比较,证明该制剂二次注射是否具有ABC现象。将两次注射间隔时间分为3天、5天和7天三组,比较三组药时曲线下降速度,判断ABC现象是否具有时间依赖性。将注射剂量分为高、中、低三组,通过药时曲线下降快慢判断ABC现象是否具有剂量依赖性。在研究该现象的剂量因素时,由于临床实际应用时多数纳米载体多次给药剂量相等,因此课题组设计了前后两次给药剂量相同的高、中、低组,结果显示高剂量ABC现象最强,中剂量最弱,考虑到原因可能是由于当前后两次注射剂量相等时,高、中、低剂量三组之间的二次注射剂量不同,导致对最终结果的分析判断不够平行。因而在此基础上进一步设计了首次给药分高、中、低剂量,第二次给药均为中剂量的三组实验,将二次给药后的药时曲线与只给一次中剂量的药时曲线分别作对比,考察首次注射剂量不同对二次注射后ABC现象的影响。在考察各组大鼠血药浓度的同时,同步设计了与以上各组给药方式相同的肝、脾组织药物蓄积实验,在注射后30 min取出肝、脾组织,以HPLC法检测各组织中药物浓度,并进行对比考察;(3)针对上一步中血液药物清除加快,用ELISA法对应地考察了不同间隔天数与不同剂量下血液中抗PEG-Ig M量的变化情况。针对上一步中组织药物蓄积增多,用Western blotting法考察了GNA原料药组、空白PEG-Liposomes组与PEG-GNA-Liposomes组的肝组织中ABCA1、MDR1、ABCG1转运体在注射三天后的表达量变化情况。结果:(1)确定以溶剂注入法制备PEG-GNA-Liposomes的最优工艺与处方:GNA:6 mg,HSPC:135 mg,胆固醇:11.3 mg,m PEG-PE:11.3 mg,有机溶剂乙醇:2m L,四氢呋喃:1ml,蒸馏水:24 m L,制备温度为60℃,搅拌速度1400 rpm/min,搅拌时间为3 h。最优处方下的PEG-GNA-Liposomes的制备的PEG-GNALiposomes呈类球形,边缘无粘连,平均粒径为124.4 nm,Zeta电位值为(-29.6±0.35)m V,制剂在4℃条件下30天内较稳定,其体外释放符合Higuchi方程,具备一定缓释效应。(2)PEG-GNA-Liposomes在SD大鼠体内二次注射具有ABC现象,且该现象随两次给药时间间隔的增加而递减。考察剂量对ABC现象的影响时,当前后两次给药相等,高剂量组ABC现象最强,中剂量组最弱;当将首次剂量分组,第二次给相同剂量时,ABC现象随首次给药剂量的减少而递减。(3)Ig M检测结果显示:首次注射PEG-GNA-Liposomes后,大鼠血清中抗PEG-Ig M的含量随两次给药时间间隔的递增而递减,首次注射高、中、低剂量的PEG-GNA-Liposomes时,五天后血清中抗PEG-Ig M含量随剂量的增加而增加,即抗PEG-Ig M的产生具有时间与剂量依赖性。WB结果显示,注射三天之后的肝组织中GNA原料药组、空白PEG-Liposomes组与PEG-GNA-Liposomes组的ABCA1相较于空白组均上调,其中PEG-GNA-Liposomes组上调程度最高,空白PEG-Liposomes次之;空白PEG-Liposomes组与PEG-GNA-Liposomes组能引起MDR1表达的上调,GNA原料药组MDR1表达量无明显变化;PEG-GNA-Liposomes组亦能引起ABCG1表达量的明显上调,而GNA原料药组与空白PEG-Liposomes组ABCG1表达量无明显变化。结论:作为PEG化纳米载体的PEG-GNA-Liposomes二次注射时可产生ABC现象,且该现象具有剂量和时间依赖性——在首次注射高剂量(1.825 mg/kg)与注射间隔天数为三天时表现出最强的ABC现象,即药物在血液中清除最快且肝脾蓄积量最多。大鼠体内产生抗PEG-Ig M的含量与ABC现象强弱相关,含量越多时,ABC现象越明显。然而WB结果显示ABC家族转运体表达上调的结果与肝组织中药物蓄积量增多的现象相悖,具体机制还需要后续实验人员进一步研究证实。