纤维素在地球上分布广泛,是一种可利用的天然高分子物质。β-葡萄糖苷酶（BGL）是纤维素水解过程中的关键限速酶。目前,BGL通过理性设计仍然无法同时提高产物耐受性与其活性。另外,酿酒酵母乙醇发酵温度与BGL最适温度差距较大。本研究以实验室自主筛选的草酸青霉16中的BGL为研究对象,从中提取总RNA,通过逆转录手段获得BGL的cDNA,再进行PCR扩增获得了去除信号肽的16BGL基因。以16BGL基因序列为模板,进行了一轮易错PCR,采用七叶苷与柠檬酸铁铵为底物的平板显色法,结合96孔板高通量筛选方法,再通过摇瓶进行复筛,最终,获得了目的突变体Y-1-B1。Y-1-B1的最适温度为50℃,比16BGL低了20℃。Y-1-B1的比活在40、45、50和80℃分别达到了213.3、405.6、505.3和151.7 IU/mg,与16BGL相比,分别提高了70%、120%、80%和190%。Y-1-B1的催化效率常数k_cat/K_m达到了1354.94 mM^-1S^-1,其产物抑制强度K_appm/K_I值为1.13（当20 mmol/L葡萄糖时）,分别是16BGL的1.68倍和0.89倍（Y-1-B1葡萄糖的耐受性提高了12%）,体现了更高的产物耐受性和活性。此外,在纤维素的同步糖化和发酵过程中额外添加Y-1-B1时,它的乙醇产量达到6.85 g/L,比16BGL的乙醇产量提高了22%。模型构建及分子对接研究结果表明,Y-1-B1的突变位点为S414、V421和S441,这些突变位点远离活性位点口袋,因此推测这些改善的酶学性质与活性位点口袋无关,这提醒我们不要忽略远离催化中心的其他位点。总之,本研究通过一轮共定向进化,获得了产物耐受性、活性和最适温度同时改善的突变体,其在生物乙醇生产上具有潜在的应用价值。