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乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)是一种丝氨酸水解酶,它的主要生物功能是在胆碱能突触间隙处快速水解神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine, ATCh),使神经递质乙酰胆碱的量维持正常水平,保证神经冲动的传递。AChE在临床上是多种疾病早期诊断的标志物,在食品安全、军事领域和环境监测中常被用作检测有机磷毒物的分子识别物。老年痴呆症,又被称为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),是一种神经系统疾病,病情呈进行性发展,严重威胁老年人的身心健康。目前临床上最常用的治疗AD的药物是AChE抑制剂,这些药物多为人工合成,选择性差,破坏外周其它胆碱能系统,存在不同程度的副作用,对AD的治疗并不能取得让人满意的效果。高通量筛选和寻找新型的AChE天然抑制剂,可为发现治疗AD的药物开辟新途径。本论文以DNA稳定的荧光银纳米簇(DNA-stabilized fluorescent silver nanoclusters, DNA-AgNCs)和香豆素460为载体,分别建立可靠、敏感的检测AChE的活性及筛选其抑制剂的新方法。论文包括三个部分：第一章为绪论,对AChE的结构、功能及其与阿尔茨海默症的关系作了简要综述；概括了AChE活性检测研究现状和AChE抑制剂研究现状。第二章建立了一种基于DNA-AgNCs高灵敏检测AChE活性和进行抑制剂筛选的新方法。在水相中合成的被寡聚核苷酸保护的具有荧光性质的银纳米簇具有较强的荧光,良好的光谱和光物理性质。本章首先以不同模板DNA合成了多种DNA-AgNCs,比较了它们的荧光性能及对巯基胆碱的响应。最后选定以12个胞嘧啶为模板合成的dC(12)-AgNCs用于实验测定,因dC(12)-AgNCs具有较强的荧光且巯基胆碱使dC(12)-AgNCs的荧光增强。根据氯化硫代乙酰胆碱能被AChE催化水解产生TCh; dC(12)-AgNCs与TCh反应能使dC(12)-AgNCs的荧光增强,开发了一种基于dC(12)-AgNCs的检验AChE活性的荧光新方法。选取了两种AChE的典型抑制剂他克林、加兰他敏,研究了dC(12)-AgNCs用于AChE抑制剂的筛选。本方法具有高特异性,背景干扰小,检测灵敏度高。对AChE活性检测的检出限为0.00005U/mL。而且,与Ellman方法一样,本方法操作简单,反应快速,有望被广泛应用到神经生物学,毒理学,药理学等许多重要领域。第三章介绍了一种AChE抑制剂筛选的新方法。首先从酶动力学、荧光光谱法和分子对接等方面研究了香豆素460与AChE之间的相互作用。研究表明：香豆素460对AChE的活性有一定的抑制作用,得到导致酶活力下降一半所需的抑制剂浓度为IC50=89.8±0.7μM。进而通过抑制动力学研究了香豆素460对AChE的抑制类型,结果表明为混合Ⅱ型竞争抑制,并求得KI=(7.17+0.30)×104mo1.L-1,KIs=(5.18±0.28)×104mo1·L-1,抑制常数KI>KIs。荧光光谱法研究表明,香豆素460可使AChE的内源荧光猝灭,本身的荧光增强,即二者能发生荧光共振能量转移。分子对接研究表明香豆素460与AChE的活性位点丝氨酸的羟基以共价键的形式结合,并与SER124形成氢键。最后基于荧光共振能量转移的原理开发了一种配体亲和竞争AChE抑制剂筛选的新方法。因AChE具有酪氨酸和色氨酸残基,290nm激发时,在340nm处有荧光发射,其本身可作为FRET的供体。选择香豆素460为荧光基准配体。在香豆素460,AChE体系中,290nm激发时,观察到AChE中色氨酸残基在340nm处的荧光淬灭,同时观察到香豆素460在460nm处的特征荧光增强。当在反应体系中加入另一种药物分子时,若该药物小分子对AChE的抑制作用强于香豆素460,则发生竞争性结合,香豆素460部分或全部从酶分子上被置换,由于香豆素460与色氨酸残基之间距离增大,FRET不再发生。香豆素460在460nm处的荧光强度下降,据此来确定不同未知药物分子与AChE的结合作用。以加兰他敏和石杉碱甲为例,研究了香豆素460和AChE复合物用于AChE抑制剂的筛选。该方法可进行同体系测定,操作简便,成本低,且不依赖专门的仪器,有望实现高通量筛选。