研究背景慢性牙周炎是由菌斑微生物引起的慢性非特异性炎症,以造成牙周组织破坏、牙槽骨吸收和病理性牙周袋为特征,引起牙周支持组织的破坏,导致牙齿松动脱落,是造成成年人后天性牙齿缺失的主要原因。学者们按照循证医学的原则进行了大规模的流行病学观察或病例对照研究,并采用科学的统计分析方法,发现牙周感染可能是心脑血管疾病、糖尿病、妊娠并发症、呼吸道感染、类风湿性关节炎等疾病的独立危险因素,或两种疾病具有共同危险因素。慢性牙周炎是发生在口腔局部的炎症性疾病,糜烂的牙周袋上皮为细菌、细菌产物和炎症介质的慢性来源。这么大面积的隐匿病灶如果长期存在不加以控制,不仅造成口腔局部严重的炎症,破坏牙周支持组织,细菌及其有毒产物、炎症介质还可以通过血液进入循环系统,感染其他器官；此外,还会启动机体的免疫应答,使宿主细胞释放细胞因子和炎症介质,导致机体处于炎症状态。糖尿病被世界卫生组织定为目前严重影响全人类健康的三大疾病之一,在全球的发病情况不容乐观。Ⅱ型糖尿病也称非胰岛素依赖型糖尿病,源于组织对胰岛素的敏感性降低,即胰岛素抵抗现象和胰岛素产生障碍,是胰岛素分子或其受体水平的缺陷状态。牙周炎作为糖尿病的第六大并发症,它与糖尿病之间的关系一直是学术界研究的重点。目前,糖尿病与牙周炎二者之间的双向关系已经被证实。糖尿病是牙周炎的独立危险因素,慢性牙周炎不利于糖尿病患者的血糖控制。II型糖尿病胰岛病变的特点之一是p细胞数量不足,凋亡增加。发生II型糖尿病时,胰岛素敏感组织产生的炎症因子导致循环系统中IL-6和TNF-a水平升高。多种细胞因子都对p细胞凋亡有诱导作用。促炎症因子(IL-1, TNFα, IFNγ)可以通过一氧化氮使钙离子在内质网集聚,破坏钙离子依赖蛋白,使内质网压力增加,诱导细胞凋亡。除此之外,TNF-a可能直接作用于胰岛细胞凋亡。IL-1β会导致Fas表达的增加,促进p细胞凋亡；IL-1β还能促进蛋白激酶C的活化,通过凋亡机制引起胰岛p细胞的破坏。目前国内外尚未见到关于慢性牙周炎对T2DM的胰腺影响的研究。课题组前期研究发现,在肥胖大鼠模型中,牙周炎可以促进胰岛素抵抗的发展,促进胰岛结构紊乱,并与胰岛素抵抗指数呈正相关,提示在低度慢性炎症机体下,牙周炎可能通过促进胰岛细胞的破坏而影响其功能。因此,本研究在前期研究基础上,拟通过建立II型糖尿病OLETF大鼠合并牙周炎的动物模型,研究牙周炎对糖尿病机体胰岛细胞凋亡相关机制的影响,初步探讨牙周炎对糖尿病大鼠胰腺病变的影响及可能机制。第一章牙周炎复合糖尿病大鼠模型的建立目的利用自发II型糖尿病的OLETF大鼠,通过丝线结扎联合涂菌法,建立II型糖尿病复合牙周炎模型,为进一步研究牙周炎对II型糖尿病大鼠胰岛组织形态和凋亡相关蛋白表达奠定基础。方法(1)自发Ⅱ型糖尿病OLETF大鼠30只,4周龄,雄性;其同种系同周龄糖耐量正常对照LETO大鼠20只。OLETF大鼠和LETO大鼠实行牙周炎干预前分别称为O组和L组。每四周行一次口服糖耐量检测(OGTT),36周龄时,将到达糖耐量受损期(IGT期)的26只OLETF大鼠,随机分为两组,一组行牙周炎造模,称为复合组(O CP(+)组),另一组为糖尿病组(O CP(-)组)；LETO大鼠也随机分为两组,一组行牙周炎造模即牙周炎组(L CP(+)组),另一组为正常组(L CP(-)组)。(2)采取丝线结扎和涂菌法建立实验性牙周炎模型。将3.0丝线分别结扎于左、右上颌第一磨牙(molar1, M1)及第二磨牙(molar2, M2)牙颈部并尽量将结扎好的丝线压入深牙周袋内,以完全没入牙龈为准,将浓度为109CFU/ml的4种标准菌(牙龈卟啉单胞菌、伴放线嗜血杆菌、中间普氏菌、具核梭杆菌)混合悬液接种于龈沟内。(3)56周龄时,处死所有实验大鼠,采集血清检测大鼠血清胰岛素水平；收集组织样本,颌骨样本进行Micro-CT扫描,EDTA脱钙后常规脱水包埋,切片行HE染色,观察牙周炎症状态。结果(1)比较四组大鼠HOMA-IR值,O CP(+)组胰岛素抵抗指数显著高于O CP(-)组(t=-0.6058,p=0.000), LCP(-)组和L CP(+)组之间没有显著差异(t=1.721,P=0.107)。(2)比较四组大鼠牙槽骨吸收体积,O CP(+)组与L CP(+)组牙槽骨骨丧失量明显分别大于O CP(-)组和L CP(-)组,差别具有统计学意义(t=4.296,P=0.013；t=5.963,P=0.004)。(3)观察四组大鼠牙周组织切片HE染色,L CP(-)组及O CP(-)组大鼠牙龈结合上皮附着紧密,牙龈和牙周膜胶原纤维排列有序,上皮下固有层极少量炎细胞浸润。L CP(+)组和O CP(+)组大鼠牙龈上皮钉突变长,牙龈牙周膜胶原纤维排列紊乱、破坏,上皮下固由层大量炎细胞浸润,O CP(+)组炎症更重,上皮钉突甚至呈条索状。结论(1)本实验利用OLETF糖尿病大鼠模型,采用丝线结扎联合涂菌法进行牙周炎造模,成功建立了牙周炎复合II型糖尿病动物模型。(2)本实验结果提示单纯牙周炎并不会引起大鼠胰岛素抵抗,但是在T2DM状态下,牙周炎通过加重机体的炎症水平,加重胰岛素抵抗程度。第二章牙周炎对糖尿病大鼠胰腺组织形态的影响目的通过牙周炎复合糖尿病模型大鼠胰腺组织形态及相关代谢的观察,初步探索牙周炎对糖尿病大鼠的组织病理学影响机制。方法胰腺组织固定后,常规脱水包埋,制成石蜡切片,分别行HE染色、MASSON染色和胰岛素抗体免疫组化染色,在光学显微镜下观察胰腺尤其是胰岛的组织形态。结果(1)HE染色结果显示, LCP(-)组和L CP(+)组大鼠胰岛细胞成团分布于外分泌腺中,胰岛细胞胞核蓝染,胞质淡染,胰岛与外分泌腺边界清晰。相对于正常组大鼠,O CP(-)组大鼠胰岛组织结构出现异常,胰岛细胞排列紊乱,与外分泌腺边界不清。O CP(+)组大鼠胰岛形态紊乱更重,有外分泌腺长入胰岛,胰岛被增生纤维分割,外分泌腺中出现脂肪异位沉积。(2) MASSON染色结果显示,L CP(-)组和L CP(+)组大鼠胰岛内几乎没有纤维组织,胰岛外围有菲薄的结缔组织被膜包绕,与外分泌腺边界清晰。O CP(-)组大鼠胰岛内纤维组织增多呈淡蓝色,在外分泌腺也观察到纤维成分增多。OCP(+)组大鼠胰岛结构紊乱,大量纤维组织机化替代正常胰岛细胞,脂肪异位沉积。(3)胰岛素抗体免疫组化结果显示,L CP(-)组和L CP(+)组大鼠胰岛中大部分细胞为p细胞,而且分布在中央呈阳性表达强,形状规则。0CP(-)组大鼠p细胞细胞分布不规则,有弥散趋势,阳性表达减弱。O CP(+)组大鼠胰岛p细胞数量明显减少,胰岛内出现纤维分隔。结论本实验观察结果提示在健康机体中,单纯的慢性牙周炎并不会引起大鼠胰岛组织形态的改变；但糖尿病机体内,牙周炎可能通过加重胰腺的病理改变,破坏胰岛的正常分泌功能,从而加重糖尿病大鼠的代谢机能异常。第三章牙周炎对糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡相关蛋白表达的影响目的通过检测胰岛细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达,探索牙周炎对糖尿病大鼠胰岛病变影响的可能凋亡机制。方法大鼠胰腺行凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3免疫组化染色,进行半定量分析,比较四组大鼠胰岛中凋亡相关蛋白表达量。结果(1)Bax蛋白在O CP(+)组的表达比O CP(-)组强,并且差异具有统计学意义(t=7.123,p=0.000).L CP(-)组和L CP(+)胰岛中Bax蛋白表达很弱,两组间没有显著差异(t=-1.022,P=0.324)。(2)Bcl-2蛋白在L CP(+)组和L CP(-)组表达较其余两组强,但两组间表达没有统计学差异(t=1.814,P=0.091),O CP(+)组蛋白表达最弱,与O CP(-)组相比,差异具有统计学意义(t=-2,565,P=0.022)。(3) Caspase-3蛋白在O CP(+)组表达强于O CP(-)组,两组之间差异有统计学意义(t=7.134,P=0.000)；在L CP(+)组和L CP(-)组表达都很弱,且两组间表达没有显著差异(t=-0.190,P=0.852)。结论本实验结果提示糖尿病状态下,慢性牙周炎可能通过调控相关凋亡蛋白的表达,影响促进/抑制细胞凋亡的平衡,从而破坏机体的胰岛相关功能,提示在糖尿病合并牙周炎状态下,胰岛细胞向促凋亡方向发展。